α-硫辛酸對(duì)撲熱息痛肝損傷小鼠的保護(hù)作用及對(duì)CYP450和CYP2E1的影響.pdf

1、目的： 研究α-硫辛酸（Alph-Lipoic Acid，α-LA）單次及連續(xù)灌胃給藥對(duì)撲熱息痛（acetaminophen，AAP）所致肝損傷小鼠的保護(hù)作用及對(duì)CYP450含量和CYP2E1酶活性的影響。 方法： 1.離體氧自由基模型的建立采用H2O2/Fe2+體系，通過(guò)Fenton反應(yīng)生成羥自由基（·OH）；通過(guò)上述Fenton反應(yīng)生成·OH，進(jìn)而造成小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化以及造成紅細(xì)胞（RBC）懸液中的RBC

2、溶血；并根據(jù)UV-754分光光度計(jì)所測(cè)吸光度A536、A532、A500，計(jì)算α-LA的·OH清除率以及對(duì)·OH所致的脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率和RBC溶血抑制率，從而分別計(jì)算參數(shù)SC50（清除50%·OH所需藥物濃度）和IC50（抑制50%損傷所需藥物濃度）。 2.小鼠肝損傷整體動(dòng)物模型的建立采用AAP單次ig500mg/kg制備肝損傷模型。在AAP肝保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，小鼠單次或連續(xù)3天ig給藥后ig AAP500 mg/kg，12小時(shí)后取

3、血及肝臟組織，測(cè)定血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活力，肝臟丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽（GSH）含量，并計(jì)算有關(guān)參數(shù)ID50（抑制50%所需劑量）；光鏡下觀察上述肝損傷組織形態(tài)學(xué)改變；另取肝組織制備肝微粒體。 3.肝微粒體制備采用Ca沉淀法制備肝微粒體懸液，并用Lowry法測(cè)定肝微粒體蛋白濃度。 4.CYP450含量及CYP2E1酶活性的測(cè)定采用CO還原差示分光光度法測(cè)定小鼠肝臟CYP450含量，通過(guò)測(cè)定苯胺羥化酶（AN

4、H）活性以反映CYP2E1酶活性。 5.小鼠戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的測(cè)定雄性小鼠分別ig給藥1h后ip35 mg/kg戊巴比妥鈉（0.2mL/10g），以小鼠翻正反射消失時(shí)為入睡時(shí)間，即潛伏期，從小鼠翻正反射消失至恢復(fù)時(shí)間為睡眠時(shí)間。 結(jié)果： 1.α-LA對(duì)離體氧自由基生成的清除作用（1）α-LA清除·OH作用呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系；其清除作用強(qiáng)大，強(qiáng)于VitC（SC50，α-LA0.028 mol/L vs SC50，V

5、itC0.049 mol/L）。（2）α-LA抑制小鼠肝勻漿體外脂質(zhì)過(guò)氧化呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系：其IC50為0.269mol/L，作為陽(yáng)性對(duì)照藥的VitC的IC50為0.422mmol/L。上述兩種藥物抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用的強(qiáng)度順序?yàn)棣?LA>VitC。（3）α-LA抑制·OH引發(fā)的RBC溶血作用亦呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系；其IC50為0.216mmol/L，小于VitC的IC50（0.358mmol/L）。表明上述兩藥的作用強(qiáng)度順序?yàn)棣?LA>Vit

6、C。 2.α-LA對(duì)AAP肝損傷小鼠的保護(hù)作用給藥組小鼠分別按50mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg和400 mg/kg劑量igα-LA，然后ig AAP500 mg/kg。與肝損傷模型組相比，單次igα-LA能劑量依賴(lài)性降低MDA含量，其ID50為174.52mg/kg；可使GSH含量增加，且呈劑量依賴(lài)性，其ID50為190.29mg/kg；但對(duì)GPT活力沒(méi)有影響（P>0.05）。連續(xù)3天igα-LA之小鼠表現(xiàn)

7、為GSH含量明顯升高，GPT活力和MDA含量明顯降低，且呈劑量依賴(lài)性，其ID50分別為159.84mg/kg、151.77mg/kg和167.31mg/kg。與肝損傷模型組相比，給藥組肝病理形態(tài)明顯改善，肝竇擴(kuò)張減輕，肝細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞形態(tài)接近于正常。 3.α-LA對(duì)AAP肝損傷小鼠CYP450含量和CYP2E1活性的影響在AAP誘發(fā)的小鼠肝損傷模型中，單次igα-LA50～400 mg/kg對(duì)已升高的肝微粒體CYP450含

8、量和CYP2E1活性沒(méi)有影響（P>0.05）。連續(xù)3天igα-LA，每天2次，可使已升高的CYP450含量及CYP2E1酶活性明顯降低，與模型組相比，其抑制率分別為48.4%和39.3%，且有劑量依賴(lài)性。 4.α-LA對(duì)正常小鼠CYP450含量和CYP2E1活性的影響單次igα-LA對(duì)正常小鼠肝微粒體CYP450含量和CYP2E1酶活性沒(méi)有影響（P>0.05），連續(xù)3天igα-LA可減少CYP450含量并抑制CYP2E1酶活性（

9、P<0.01），其抑制率分別為41.1%和32.3%。說(shuō)明α-LA連續(xù)給藥可抑制肝微粒體細(xì)胞色素氧化酶。 5.戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的佐證單次igα-LA對(duì)正常小鼠戊巴比妥鈉睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間沒(méi)有影響（P>0.05）。連續(xù)igα-LA100 mg/kg和400 mg/kg，2次/d，共3d致小鼠睡眠時(shí)間由未給藥的平均35.84 min延長(zhǎng)至81.20 min和158.42 min。從而佐證α-LA對(duì)CYP450具有抑制作用。

10、 結(jié)論： 1.α-LA具有十分強(qiáng)大的體外氧自由基清除作用，SC50和IC50數(shù)據(jù)表明，α-LA在上述3種模型中的抗氧自由基作用均強(qiáng)于VitC。 2.α-LA連續(xù)ig3天對(duì)AAP誘發(fā)的小鼠肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，連續(xù)3天igα-LA可使GSH含量明顯升高，MDA含量和GPT水平明顯降低，肝臟病理明顯改善。 3.α-LA連續(xù)3天ig可使AAP肝損傷小鼠已升高的CYP450含量及CYP2E1酶活性明顯降低，且有劑量

11、依賴(lài)性。提示α-LA通過(guò)這一作用可使AAP體內(nèi)代謝降低，毒性產(chǎn)物N-乙酰-對(duì)-苯醌亞胺生成減少，從而成為α-LA對(duì)AAP肝損傷保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。 4.α-LA連續(xù)3天ig亦可使正常小鼠CYP450含量和CYP2E1酶活性明顯降低，并可明顯延長(zhǎng)戊巴比妥鈉引起的小鼠睡眠時(shí)間，說(shuō)明α-LA連續(xù)給藥可抑制肝微粒體細(xì)胞色素氧化酶。 5.單次igα-LA對(duì)AAP誘發(fā)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用不明顯，對(duì)肝損傷小鼠和正常小鼠的CYP4