RNA干擾及厄洛替尼阻斷EGFR信號途徑對肺腺癌A549抗增殖作用及其機制研究.pdf

1、目的:研究RNA干擾及厄洛替尼兩種途徑阻斷表皮生長因子受體(EGFR)信號對肺腺癌A549細胞株形態(tài)學(xué)的影響，EGFRmRNA表達、凋亡率及EGFR及Bcl-2、Bax蛋白表達的變化，從而為肺癌的分子靶向治療提供新思維。
　　 方法:人肺腺癌A549細胞株以含10％胎牛血清的PRMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5％CO2飽和濕度的恒溫箱內(nèi)。實驗分正常對照組、厄洛替尼組、RNA干擾組。EGFR基因中的序列以及siRNA設(shè)計原則

2、設(shè)計合成設(shè)計相應(yīng)的siRNA，并轉(zhuǎn)染A549細胞48h后提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后A549細胞株中EGFRmRNA的變化。取適量DMSO液容解厄洛替尼母液，均于實驗前以PRMI1640培養(yǎng)基稀釋至50μmol/L，藥物干預(yù)48h。倒置舊差顯微鏡下觀察各實驗組細胞形態(tài)學(xué)變化，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，Westernblot檢測EGFR、Bcl-2、Bax蛋白的變化。實驗數(shù)據(jù)以X±s表示，用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分

3、析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、倒置相差顯微鏡下細胞形態(tài)學(xué)變化
　　 A.空白對照組:細胞生長良好，緊貼瓶壁排列，可見細胞核分裂相。
　　 B.厄洛替尼組:細咆間隙增寬，正常細胞形態(tài)消失，細胞貼壁疏松，仍見多量貼壁生長的細胞。
　　 C.RNA干擾組:細胞生長抑制更為顯著，細胞形態(tài)不能辨認，細胞皺縮脫落呈透亮空泡，無貼壁生長細胞。
　　 2.、RT-PCR檢測

4、EGFRmRNA/GAPDH相對光密度比值影響。
　　 空白對照組、陰性RNA對照組、實驗組、脂質(zhì)體2000對照組EGFRmRNA/GAPDH相對光密度值分別為0.76、0.72、0.31、0.70，陰性RNA對照組及脂質(zhì)體2000對照組與與空白對照組差異無統(tǒng)計(P＞0.05)學(xué)意義，而實驗組光密度值較空白對照組差異顯著(P＜0.05)，證實RNA干擾可抑制EGFR基因表達。
　　 3、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的變化.

5、r>　　 流式細胞術(shù)分析顯示:對照組、厄洛替尼組、RNA干擾組肺腺癌A549細胞的凋亡率分別為23.5％、57.4％、83.2％，阻斷EGFR信號途徑可促進A549細胞凋亡，其差異較對照組有統(tǒng)計學(xué)意義((P＜0.05)。
　　 4、Westernblot檢測EGFR、Bcl-2、Bax相對蛋白量表達的影響
　　 Westernblot分析顯示與對照組相比，厄洛替尼組及RNA干擾組EGFR表達降低，Bcl-2水平表達降低