鐵代謝在肺癌中的異常改變及對構(gòu)建種移植瘤的影.pdf

1、肺癌是一種發(fā)病率、死亡率很高的惡性腫瘤，尤其是近50年來，在歐美等發(fā)達國家和我國的某些工業(yè)城市，肺癌發(fā)病率已躍居各種惡性腫瘤之首，且呈現(xiàn)年輕化、女性化的趨勢。在美國及全球范圍內(nèi)，肺癌已居癌癥死亡原因的首位。肺癌全稱為支氣管肺癌，是起源于支氣管粘膜上皮的惡性腫瘤，在肺癌的病理類型中非小細胞肺癌占了絕大多數(shù)，高達85％，小細胞肺癌占15％。非小細胞肺癌可分為三個主要組織學(xué)亞型：鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞肺癌。在肺癌的病因研究中，目前普遍公認吸

2、煙是導(dǎo)致大多數(shù)韻肺癌發(fā)生的原因之一，但是仍有25％的肺癌不可歸因于吸煙，并且每年死亡的人數(shù)超過30萬。雖然非小細胞肺癌的早期診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療策略在不斷改進，但是其早期診斷的手段仍然不足，預(yù)后也較差。目前肺癌的治療仍以手術(shù)、化療、放療為主，但是占肺癌大多數(shù)的非小細胞肺癌對化療不敏感，5年生存率仍然較低，因此，進一步尋找非小細胞肺癌早期診斷手段、治療策略和預(yù)防方法已成為國內(nèi)外研究的熱點。
　　 鐵是人體必需的微量元素之一，對細胞的正常

3、生長及維持細胞正常功能有決定性作用。作為一種過渡元素，鐵是合成DNA限速酶核酸核苷酸還原酶的輔基，參與DNA合成、電子傳遞等重要的生命代謝過程。哺乳動物中血紅蛋白介導(dǎo)的氧氣的運輸、多種酶的活性包括過氧化氫酶，都涉及鐵的參與，并起重要作用。鐵能減少線粒體產(chǎn)生ATP時產(chǎn)生的氧，在能量通路中扮演重要角色。同時，鐵在免疫系統(tǒng)及維持正常的免疫功能中起重要作用。另外，因為鐵具有減少氧的能力，鐵是大多數(shù)生化體系中自由基的主要誘導(dǎo)劑。已發(fā)現(xiàn)多種疾病存在

4、鐵代謝異常，如肝炎、糖尿病、帕金森綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥等。
　　 惡性腫瘤的發(fā)生是細胞惡性增殖、凋亡不足的結(jié)果，所有涉及細胞代謝、增殖、凋亡的多種因素都可能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前認為鐵含量升高是腫瘤發(fā)生的危險因素，鐵和腫瘤具有相關(guān)性。已發(fā)現(xiàn)多種癌癥患者體內(nèi)存在鐵代謝異常，參與鐵代謝的各種標(biāo)志物水平發(fā)生改變：(1)鐵蛋白(Ferritin，F(xiàn)n)，尤其血清Fn水平，在多種腫瘤中明顯增加，研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細胞

5、瘤中，血清Fn起到自分泌生長因子的作用，并且和腫瘤分期具有相關(guān)性，具有提示患者預(yù)后的作用；(2)轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，Tf)，在體內(nèi)將鐵從外周血轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，可作為細胞的生長因子，無論是體內(nèi)細胞還是體外細胞，某些腫瘤組織自身可合成轉(zhuǎn)鐵蛋白，促進細胞增殖和分化；(3)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)，目前發(fā)現(xiàn)有兩種：TfR1和TfR2。相關(guān)研究表明，TfR1在多種腫瘤中表達明顯增多，如腦腫瘤，T

6、fR1單克隆抗體可抑制體外腫瘤細胞的生長；(4)鐵調(diào)節(jié)蛋白(Iron regulatory Protein，IRP)，通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)鐵蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達來調(diào)控細胞的體代謝。IRP分為IRP1和IRP2，體外實驗表明IRP1與IRP2能識別并結(jié)合各自特異的靶RNA序列，而且IRP2對IRE結(jié)構(gòu)的自然變異比IRP1敏感。一些培養(yǎng)細胞(如鼠J774巨噬細胞)的鐵代謝調(diào)節(jié)中，IRP2起主導(dǎo)作用，甚至部分只表達IRP2，提示IRP2可作為

7、細胞內(nèi)鐵平衡的唯一調(diào)節(jié)劑。
　　 已有鐵與腫瘤關(guān)系的研究，但關(guān)于肺癌方面的研究較少，且多是檢測血清鐵代謝相關(guān)蛋白的含量、或者是鐵相關(guān)基因產(chǎn)物在組織中的表達，發(fā)現(xiàn)鐵代謝相關(guān)基因產(chǎn)物在肺癌組織或者患者血清中表達與正常對照或者與良性疾病有差異，但差異的發(fā)生原因以及鐵代謝在肺癌發(fā)生中的作用機制未見報道。本研究擬從分子，細胞，組織到動物四個層次進行研究，以進一步探討其機制：(1)從基因水平和蛋白水平檢測肺腺癌患者的癌組織及正常肺組織標(biāo)本鐵

8、代謝標(biāo)志物Fn、Tf、TfR、IRP2的表達；(2)采用反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染技術(shù)使A549細胞IRP2基因沉默，觀察對鐵代謝其他標(biāo)志物的影響；(3)體外培養(yǎng)A549細胞，通過不同濃度的鐵劑(三氯化鐵，F(xiàn)eCl3)和鐵螯合劑(去鐵胺，DFO)，觀察對細胞的增殖、凋亡的影響，同時探討相應(yīng)狀態(tài)下鐵代謝標(biāo)志物的基因和蛋白表達情況；(4)在此基礎(chǔ)上，用不同濃度的鐵劑和鐵螯合劑作用后的A549細胞，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，研究鐵在動物體內(nèi)對腫瘤的影響，進一

9、步探討鐵與肺癌發(fā)生的關(guān)系。
　　 本實驗從分子水平、基因水平、蛋白水平、細胞水平、組織水平、體內(nèi)試驗等多個研究層面，采用免疫組織化學(xué)、Western blot、PCR、RT-PCR、MTT法、Tunel法、流式細胞術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳、反義寡核苷酸技術(shù)、構(gòu)建異種移植瘤等，研究了鐵代謝在肺癌中的異常改變及機制以及對構(gòu)建裸鼠異種抑制瘤的影響，以期為肺腺癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。
　　 第一部分、鐵代謝相關(guān)基因及蛋白在肺腺癌

10、組織中的表達
　　 目的：研究肺癌組織中鐵代謝相關(guān)基因及表達產(chǎn)物是否存在異常，探討鐵代謝在肺癌發(fā)生中的機制。
　　 方法：
　　 1.采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)檢測肺癌和正常肺組織中鐵代謝相關(guān)基因Tf、TfR、Fn、IRP2的蛋白表達產(chǎn)物。
　　 2.采用RT-PCR方法檢測肺癌和正常肺組織中鐵代謝相關(guān)指標(biāo)Tf、TfR、Fn、IRP2的基因表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.Tf在肺腺癌組

11、織中陽性表達率為73.33％，在正常肺組織中陽性表達率為23.33％，二者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=15.02，P<0.05)；TfR在肺腺癌組織中陽性表達率分別為63.33％，在正常肺組織中陽性表達率為13.33％，二者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=15.86，P<0.05)；Fn在肺腺癌組織中的陽性表達率為16.66％，在正常肺組織中陽性表達率為70.00％，二者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=17.38，P<0.05)；I

12、RP2在肺腺癌組織中陽性表達率為70.00％，在正常肺組織中陽性表達率為26.66％，二者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=11.28，P<0.05)。
　　 2.Tf mRNA在肺腺癌組織相對含量為0.291±0.066，正常肺組織相對含量為0.175±0.004，二組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.400，P<0.05)；TfR mRNA在肺腺癌組織相對含量為0.441±0.031，正常肺組織相對含量為0.249±0.0

13、30，二組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-13.198，P<0.05)；肺癌中Fn mRNA相對含量為0.289±0.021，正常肺組織相對含量為0.970±0.063，二組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=30.862，P<0.05)；在肺腺癌組織IRP2 mRNA相對含量為0.275±0.022，正常肺組織相對含量為0.132±0.011，二組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.992，P<0.05)。
　　 小結(jié)：Fn在

14、肺癌中的表達降低，而Tf、TfR、IRP2表達升高，提示肺癌在發(fā)生發(fā)展過程中對鐵的需求增加，鐵利用的增加需要Tf-TfR的轉(zhuǎn)運，IRP2在其中起到調(diào)控作用。
　　 第二部分、鐵代謝在肺腺癌發(fā)生中的分子機制
　　 目的：研究IRP2基因沉默后對鐵代謝相關(guān)基因及其產(chǎn)物表達的影響，探討肺腺癌A549細胞的鐵代謝調(diào)節(jié)機制。
　　 方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)：肺腺癌A549細胞用10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液置于3

15、7℃，5％CO2培養(yǎng)，定期換液、傳代。
　　 2.IRP2 ASODN轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細胞將肺腺癌A549細胞分為三組：對照組(含脂質(zhì)體20μl/ml)；ASODN組；SCODN組。
　　 3.采用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前后Tf、TfR、Fn等鐵代謝相關(guān)基因mRNA表達。
　　 4.采用Western blot檢測IRP2及Tf、TfR、Fn等鐵調(diào)節(jié)相關(guān)基因蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.AS

16、ODN轉(zhuǎn)染后形態(tài)的改變ASODN轉(zhuǎn)染組細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞核固縮，核碎裂，染色質(zhì)片斷化，分裂相少見，凋亡小體形成等。而對照組及SCODN組細胞形態(tài)基本正常，貼壁生長良好。
　　 2.轉(zhuǎn)染前后Tf、TfR及Fn mRNA表達的改變
　　 ①TfmRNA：對照組、SCODN組和ASODN組分別為：0.440±0.049、0.418±0.040、0.468±0.052，三組之間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.18，P>0.05)

17、；
　　 ②TfR mRNA：對照組、SCODN組和ASODN組分別為：0.504±0.052、0.456±0.096、0.323±0.032，三組之間表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.354，P<0.05)；三組之間兩兩比較，ASODN組與對照組和SCODN組相比，ASODN組TfR基因表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對照組與SCODN組間無顯著性差異(P>0.05)；
　　 ③Fn mRNA：對照組、

18、SCODN組和ASODN組分別為：0.360±0.048、0.391±0.032、0.555±0.065，三組之間表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.354，P<0.05)；三組之間兩兩比較，ASODN組與對照組和SCODN組相比，F(xiàn)n mRNA表達高于對照組和SCODN組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對照組與SCODN組間無顯著性差異(P>0.05)。
　　 3.轉(zhuǎn)染前后Tf、TfR、Fn、IRP2蛋白表達
　　

19、①Tf蛋白表達：對照組、SCODN組和ASODN組Tf蛋白表達分別為：0.651±0.052、0.630±0.060、0.593±0.057，三組之間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.668，P>0.05)：
　　 ②TfR蛋白表達：對照組、SCODN組和ASODN組TfR蛋白表達分別為：0.791±0.117、0.856±0.075、0.586±0.061，三組之間表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.671，P<0.05)；三組之間

20、兩兩比較，ASODN組TfR蛋白表達與對照組和SCODN組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組與SCODN組間無顯著性差異(P>0.05)：
　　 ③Fn蛋白表達：對照組、SCODN組和ASODN組Fn蛋白表達分別為：0.485±0.038、0.483±0.038、0.693±0.077，三組之間表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.748，P<0.05)；三組之間兩兩比較，ASODN組Fn蛋白表達與對照組和SCODN

21、組之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組與SCODN組間無顯著性差異(P>0.05)。
　　 ④IRP2蛋白表達：對照組、SCODN組和ASODN組IRP2蛋白表達分別為：0.617±0.100、0.553±0.094、0.120±0.024，三組之間表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=113.224，P<0.05)；ASODN組IRP2蛋白表達與對照組和SCODN組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對照組與SCOD

22、N組間無顯著性差異(P>0.05)。
　　 小結(jié)：
　　 1.IRP2 ASODN轉(zhuǎn)染后的A549細胞，IRP2蛋白表達顯著降低；
　　 2.IRP2 ASODN轉(zhuǎn)染A549細胞后TfR mRNA及蛋白表達降低，F(xiàn)n mRNA及蛋白表達增加，TfmRNA及蛋白表達無變化；
　　 3.在肺癌細胞中，IRP2可能通過蛋白量的改變來調(diào)節(jié)TfR和Fn的表達，進而調(diào)節(jié)鐵代謝。
　　 第三部分、不同鐵狀態(tài)對肺

23、癌細胞的增殖凋亡及鐵代謝標(biāo)志物的影響
　　 目的：研究加鐵、去鐵處理對A549細胞增殖、凋亡以及鐵代謝相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物的影響，從細胞水平探討鐵代謝對肺癌發(fā)生的作用及機制。
　　 方法：
　　 1.實驗分組：①空白對照組；②50μmol/L三氯化鐵(FeCl3)組；③100μmol/L三氯化鐵(FeCl3)組；④50μmol/L去鐵胺(DFO)組；⑤100μmol/L去鐵胺(DFO)組。
　　 2.MT

24、T法檢測A549細胞體外增殖能力。
　　 3.Tunel、流式細胞術(shù)及瓊脂糖凝膠電泳觀察A549細胞凋亡情況。
　　 4.RT-PCR檢測各組細胞鐵代謝相關(guān)指標(biāo)Tf、TfR、Fn、IRP2的mRNA水平。
　　 5.Western blot檢測各組細胞鐵代謝相關(guān)指標(biāo)Tf、TfR、Fn、IRP2的蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.FeCl3和DFO對A549細胞增殖的影響
　　 1.1 F

25、eCl3對A549細胞體外增殖的影響FeCl3-50及FeCl3-100處理A549細胞12h后增殖抑制率分別為-0.242±0.034、-0.328±0.039，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.256，P<0.05)；24h后增殖抑制率分別為-0.698±0.066、-0.943±0.071，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.997，P<0.05)；48h后增殖抑制率分別為-0.743±0.071、-1.010±0.094，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

26、t=7.167，P<0.05)。
　　 按時間梯度比較，F(xiàn)eCl3-50及FeCl3-100處理A549細胞12h、24h、48h后，增殖抑制率隨時間延長而變小(F=218.402，P<0.05)，兩兩比較，12h與24h和48h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，處理48h后增殖抑制率與24h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 1.2 DFO對A549細胞體外增殖的影響DFO-50及DFO-100處理A549

27、細胞12h后增殖抑制率分別為0.461±0.032、0.608±0.03，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.59800，P<0.05)；24h后增殖抑制率分別為0.819±0.016、0.866±0.011，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.56100，P<0.05)：48h后增殖抑制率分別為0.833±0.017、0.884±0.021，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.969，P<0.05)。
　　 用重復(fù)測量方差分析對時間梯度進行比較，D

28、FO-50處理A549細胞12h、24h、48h后，增殖抑制率隨時間延長而增高(F=850.04，P<0.05)，兩兩比較，12h與24h和48h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，處理48h后增殖抑制率與24h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；DFO-100處理A549細胞12h、24h、48h后，增殖抑制率隨時間延長而增高(F=489.27，P<0.05)，兩兩比較，12h與24h和48h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，

29、處理48h后增殖抑制率與24h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2.RT-PCR檢測FeCl3、DFO處理A549細胞后Tf、TfR、Fn、IRP2的mRNA水平
　　 2.1 FeCl3對A549細胞Tf mRNA水平的影響FeCl3處理A549細胞12hTfmRNA水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.423±0.043、0.396±0.027、0.344±0.02，三組之間差異具有

30、統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.413，P<0.05)。
　　 FeCl3處理A549細胞24hTf mRNA水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.435±0.039、0.333±0.044、0.265±0.023，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=55.099，P<0.05)。
　　 用重復(fù)測量方差分析對時間梯度進行比較，F(xiàn)eCl3-50組在12h、24hTf mRNA水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)

31、意義(P<0.05)；FeCl3-100組在12h、24hTf mRNA水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.2 FeCl3對A549細胞TfR mRNA水平的影響FeCl3處理A549細胞12h TfR mRNA水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.479±0.045、0.469±0.039、0.385±0.032，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.576，P<0.

32、05)。
　　 FeCl3處理A549細胞24hTfR mRNA水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.464±0.045、0.360±0.031、0.321±0.010，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.702，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，F(xiàn)eCl3-50組在12h、24hTfR mRNA水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.919，P<0.05)；FeCl3-100

33、組在12h、24hTfR mRNA水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.036，P<0.05)。
　　 2.3 FeCl3對A549細胞Fn mRNA水平的影響FeCl3處理A549細胞12h后Fn mRNA水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.380±0.032、0.460±0.046、0.599±0.047，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.437，P<0.05)。
　　 F

34、eCl3處理A549細胞24h Fn mRNA水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.379±0.019、0.501±0.050、0.851±0.054，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=316.410，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，F(xiàn)eCl3-50組在12h、24hFn mRNA水平隨時間延長而增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.908，P<0.072)；FeCl3-100組在12h、24hFn m

35、RNA水平隨時間延長而增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.132，P<0.05)。
　　 2.4 FeCl3對A549細胞IRP2 mRNA水平的影響FeCl3處理A549細胞12h IRP2 mRNA水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.304±0.021、0.287±0.020、0.205±0.020，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=68.144，P<0.05)。
　　 FeCl3處理A54

36、9細胞24h IRP2 mRNA水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.311±0.022、0.256±0.022、0.206±0.011，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=76.749，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，F(xiàn)eCl3-50組在12h、24h IRP2 mRNA水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.297，P<0.05)；FeCl3-100組在12h、24h IRP2 mRN

37、A水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.139，P>0.05)。
　　 2.5 DFO對A549細胞Tf mRNA水平的影響DFO處理A549細胞12hTf mRNA水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.423±0.043、0.483±0.042、0.535±0.029，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.134，P<0.05)。
　　 DFO處理A549細胞24hTf mRNA水平：對照組、DFO-50組、

38、DFO-100組分別為0.435±0.039、0.516±0.058、0.555±0.062，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.987，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，DFO-50組在12h、24hTf mRNA水平隨時間延長而增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.457，P>0.05)；DFO-100組在12h、24hTf mRNA水平隨時間延長而增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.924，P>0.05)。
　　 2

39、.6 DFO對A549細胞TfR mRNA水平的影響DFO處理A549細胞12hTfR mRNA水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.479±0.045、0.484±0.043、0.597±0.067，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.888，P<0.05)。
　　 DFO處理A549細胞24hTfR mRNA水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.464±0.045、0.521±0.039

40、、0.652±0.049，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.822，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，DFO-50組在12h、24hTfR mRNA水平隨時間延長而增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.016，P>0.05)；DFO-100組在12h、24hTfR mRNA水平隨時間延長而增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.095，P>0.05)。
　　 2.7 DFO對A549細胞Fn mRNA水平的影響DFO處理A5

41、49細胞12h Fn mRNA水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.380±0.032、0.292±0.015、0.230±0.021，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=98.313，P<0.05)。
　　 DFO處理A549細胞24h Fn mRNA水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.379±0.019、0.215±0.024、0.196±0.019，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=235.

42、643，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，DFO-50組在12h、24hFn mRNA水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.604，P<0.05)；FDFO-100組在12h、24hFn mRNA水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.797，P<0.05)。
　　 2.8 DFO對A549細胞IRP2 mRNA水平的影響DFO處理A549細胞12h IRP2 mRNA水平：對照組、DFO-5

43、0組、DFO-100組分別為0.304±0.021、0.412±0.024、0.445±0.063，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=33.015，P<0.05)。
　　 DFO處理A549細胞24h IRP2 mRNA水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.311±0.022、0.401±0.019、0.541±0.051，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=117.266，P<0.05)。
　　 按時間梯度

44、分析，DFO-50組在12h、24hIRP2 mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.136，P=0.271)；DFO-100組在12h、24hIRP2 mRNA水平隨時間延長而增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.745，P<0.05)。
　　 3.Western blot檢測FeCl3、DFO干預(yù)后A549細胞Tf、TfR、Fn、IRP2蛋白水平
　　 3.1 FeCl3對A549細胞Tf蛋白水平的影響FeCl3處理A54

45、9細胞12hTf蛋白水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.640±0.023、0.607±0.030、0.574±0.035，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.462，P<0.05)。
　　 FeCl3處理A549細胞24hTf蛋白水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.626±0.044、0.567±0.036、0.512±0.032，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.

46、810，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，F(xiàn)eCl3-50組在12h、24h Tf蛋白水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.699，P<0.05)；FeCl3-100組在12h、24hTf蛋白水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.134，P<0.05)。
　　 3.2 FeCl3對A549細胞TfR蛋白水平的影響FeCl3處理A549細胞12hTfR蛋白水平：對照組、FeCl3-50組、Fe

47、Cl3-100組分別為0.762±0.033、組0.643±0.022、0.426±0.034，三組之間TfR蛋白水平存在顯著性差異(F=316.051，P<0.05)。
　　 FeCl3處理A549細胞24hTfR蛋白水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.793±0.051、0.570±0.034、0.341±0.025，三組之間TfR蛋白水平存在顯著性差異(F=352.725，P<0.05)。

48、>　　 按時間梯度分析，F(xiàn)eCl3-50組在12h、24h TfR蛋白水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.700，P<0.05)；FeCl3-100組在12h、24hTfR蛋白水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.369，P<0.05)。
　　 3.3 FeCl3對A549細胞Fn蛋白水平的影響FeCl3處理A549細胞12hFn蛋白水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.49

49、7±0.038、0.507±0.020、0.550±0.050，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.528，P<0.05)。
　　 FeCl3處理A549細胞24hFn蛋白水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.471±0.029、0.647±0.051、0.902±0.09，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=121.661，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，F(xiàn)eCl3-50組在12h、24h

50、 Fn蛋白水平隨時間延長而增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.082，P<0.05)；FeCl3-100組在12h、24hFn蛋白水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.812，P<0.05)。
　　 3.4 FeCl3對A549細胞IRP2蛋白水平的影響FeCl3處理A549細胞12h IRP2蛋白水平：對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組分別為0.589±0.033、0.313±0.021、0.303±0.025，三組之

51、間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=364.328，P<0.05)。
　　 FeCl3處理A549細胞24h IRP2蛋白水平：對照組0.589±0.024、FeCl3-50組0.277±0.032、FeCl3-100組0.299±0.220，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.185，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，F(xiàn)eCl3-50組在12h、24h IRP2蛋白水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.974

52、，P<0.05)；FeCl3-100組在12h、24hIRP2蛋白水平隨時間延長而降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.380，P>0.05)。
　　 3.5 DFO對A549細胞Tf蛋白水平的影響DFO處理A549細胞12hTf蛋白水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.574±0.035、0.826±0.121、0.822±0.081，三組之間Tf蛋白水平存在顯著性差異(F=27.946，P<0.05)。
　

53、　 DFO處理A549細胞24hT蛋白水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.626±0.044、0.734±0.058、0.796±0.063，三組之間Tf蛋白水平存在顯著性差異(F=23.917，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，DFO-50組在12h、24h Tf蛋白水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.168，P<0.05)；DFO-100組在12h、24hTf蛋白水平隨時間延長而降低

54、，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.801，P>0.05)。
　　 3.6 DFO對A549細胞TfR蛋白水平的影響DFO處理A549細胞12hTfR蛋白水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.762±0.033、0.724±0.077、0.945±0.079，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.480，P<0.05)。
　　 DFO處理A549細胞24hTfR蛋白水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組

55、分別為0.793±0.051、0.803±0.069、0.938±0.077，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=55.869，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，DFO-50組在12h、24h TfR蛋白水平隨時間延長而增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.089，P<0.05)；DFO-100組在12h、24hTfR蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.201，P>0.05)。
　　 3.7 DFO對A549細胞Fn蛋白水平

56、的影響DFO處理A549細胞12hFn蛋白水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.497±0.038、0.380±0.039、0.319±0.036，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=57.663，P<0.05)。
　　 DFO處理A549細胞24h Fn蛋白水平：對照組、DFO-50組、DFO-100組分別為0.471±0.029、0.343±0.020、0.168±0.017，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4

57、56.794，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，DFO-50組在12h、24hFn蛋白水平隨時間延長而降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.670，P<0.05)；DFO-100組在12h、24hFn蛋白水平隨時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.994，P<0.05)。
　　 3.8 DFO對A549細胞IRP2蛋白水平的影響DFO處理A549細胞12h IRP2蛋白水平：對照組、DFO-50組、DFO-100

58、組分別為0.589±0.033、0.659±0.047、0.927±0.068，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=119.463，P<0.05)。
　　 DFO處理A549細胞24h IRP2蛋白水平：對照組0.589±0.024、DFO-50組0.725±0.049、DFO-100組0.954±0.075，三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=118.096，P<0.05)。
　　 按時間梯度分析，DFO-50組在12h、24

59、h IRP2蛋白水平隨時間延長而增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.074，P<0.05)；DFO-100組在12h、24hIRP2蛋白水平隨時間延長而增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.843，P>0.05)。
　　 4.FeCl3、DFO對A549細胞凋亡的影響
　　 4.1 A549細胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察不同濃度FeCl3和DFO處理A549細胞后，HE染色可見典型的凋亡細胞的形態(tài)學(xué)特征：細胞皺縮，折光性減弱，細胞內(nèi)顆粒增多

60、；DFO處理的A549細胞凋亡細胞明顯多于FeCl3。
　　 4.2 Tunnel法檢測細胞凋亡DFO促進A549細胞凋亡，隨時間延長、濃度增加作用增強；而FeCl3卻抑制細胞凋亡。
　　 4.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果不同濃度DFO處理A549細胞后的凋亡條帶(ladder shape)隨著濃度、時間延長明顯增寬增多，而空白對照組無DNA梯形凋亡條帶出現(xiàn)。不同濃度FeCl3處理A549細胞24h后幾乎無凋亡條帶(la

61、dder shape)出現(xiàn)。
　　 4.4 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果Annexin WPI法檢測細胞凋亡：在培養(yǎng)12h，對照組、DFO-50及DFO-100組早期細胞凋亡率(％)分別為1.40±0.01、3.02±0.05、10.32±0.51，三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2578.62，P<0.05)，兩兩比較，DFO-50及DFO-100組均較空白對照組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在培養(yǎng)24h，對照組、DFO-5

62、0及DFO-100組早期細胞凋亡率分別為2.61±0.31、4.07±0.85、13.91±1.37，三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=420.42，P<0.05)，兩兩比較，DFO-50及DFO-100組均較空白對照組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 在培養(yǎng)12h，對照組、FeCl3-50及FeCl3-100組早期細胞凋亡率分別為1.40±0.01、2.21±0.37、1.05±1.22，三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意

63、義(F=6.53，P<0.05)；兩兩比較，F(xiàn)eCl3-50及FeCl3-100組均較空白組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在培養(yǎng)24h，對照組、FeCl3-50及FeCl3-100組早期細胞凋亡率分別為2.61±0.31、1.32±1.21、0.56±1.02，三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.43，P<0.05)；兩兩比較，F(xiàn)eCl3-50及FeCl3-100組均較空白組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

64、　　 小結(jié)：
　　 1.FeCl3處理A549細胞后，細胞增殖抑制率降低，細胞凋亡減少，提示FeCl3具有促進A549細胞生長的作用；
　　 2.DFO處理A549細胞后，細胞增殖抑制率增加，凋亡細胞增多，提示DFO對A549細胞生長具有抑制作用；
　　 3.FeCl3通過升高Fn mRNA和蛋白表達、降低Tf、IRP2、TfR mRNA和蛋白表達而促進A549細胞生長；
　　 4.DFO通過降低Fn

65、mRNA和蛋白表達、升高Tf、IRP2、TfR mRNA和蛋白表達而促進A549細胞生長。
　　 第四部分、鐵對構(gòu)建人肺腺癌裸鼠異種移植瘤的影響
　　 目的：構(gòu)建加鐵去鐵處理后的A549細胞裸鼠移植瘤模型，研究不同鐵狀態(tài)的A549細胞成瘤能力，探討體內(nèi)鐵負荷對肺癌發(fā)生發(fā)展的影響。
　　 方法：
　　 1.裸鼠50只，隨機分成5組：空白對照組、FeCl3-50、FeCl3-100、DFO-50和DFO-10

66、0組。
　　 2.生理鹽水及不同濃度的FeCl3、DFO處理后的A549細胞接種至裸鼠背部皮膚，皮下注射法構(gòu)建肺腺癌裸鼠移植瘤模型。
　　 3.觀察裸鼠生存狀態(tài)、成瘤時間、移植瘤平均體積及平均瘤重、根據(jù)瘤體體積繪制成瘤曲線。
　　 結(jié)果：
　　 1.空白對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組平均成瘤時間(天)分別為6.267±0.191，4.133±0.099，3.056±0.109，三組比較差

67、異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5136.630，P<0.05)。FeCl3-100組、FeCl3-50組平均成瘤時間均短于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；FeCl3-100組平均成瘤時間短于FeCl3-50組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M、DFO-50組、DFO-100組平均成瘤時間(天)分別為6.267±0.191、7.196±0.175、9.058±0.179，三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=611.200，

68、P<0.05)；DFO-100組、DFO-50組平均成瘤時間均長于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DFO-100組平均成瘤時間長于DFO-50組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.FeCl3組裸鼠移植瘤平均體積在觀察期內(nèi)隨時間延長而增大，同一時間點FeCl3-100組平均體積大于FeCl3-50組及空白對照組，F(xiàn)eCl3-50組平均體積大于空白對照組，各時間點三組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

69、。
　　 3.DFO組裸鼠移植瘤平均體積在觀察期內(nèi)隨時間延長而增大，在第3、6、9天DFO-100、DFO-50及空白對照組平均體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在第12、15、18、21天DFO-100組平均體積小于DFO-50組及空白對照組，DFO-50組平均體積小于空白對照組，各時間點三組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.對照組、FeCl3-50組、FeCl3-100組平均瘤重(g)分別為0.535±0

70、.097、0.666±0.069、0.690±0.204，三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.73，P<0.05)；FeCl3-100組、FeCl3-50組平均瘤重均大于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；FeCl3-100組平均瘤重大于FeCl3-50組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5.對照組、DFO-50組、DFO-100組平均瘤重(g)分別為0.535±0.097、0.484±0.185、0.378

71、±0.096，三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.639，P<0.05)；DFO-100組平均瘤重小于DFO-50組和對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DFO-50組平均瘤重小于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 小結(jié)：成功構(gòu)建裸鼠肺腺癌A549細胞移植瘤模型。用鐵干預(yù)后的肺癌A549細胞接種裸鼠，發(fā)現(xiàn)加鐵干預(yù)的A549細胞接種后的裸鼠，成瘤時間縮短，腫瘤平均體積和平均瘤重大于無干預(yù)組，腫瘤生長速度加快

72、；DFO干預(yù)的A549細胞接種后的裸鼠，成瘤時間延長，腫瘤平均體積和平均瘤重小于無干預(yù)組，腫瘤生長速度減慢，表明鐵參與肺癌的發(fā)生，促進裸鼠成瘤，鐵螯合劑對動物成瘤具有抑制作用。
　　 全文小結(jié)：
　　 1.肺癌在發(fā)生發(fā)展過程中可能存在對鐵的需求增加，導(dǎo)致Fn降低，而對鐵起轉(zhuǎn)運作用的Tf-TfR的表達增加，IRP2在其中起到調(diào)控作用。
　　 2.在肺癌細胞中，IRP2可能通過蛋白量的改變來調(diào)節(jié)TfR和Fn的表達，調(diào)

73、控肺癌細胞的生長。為篩選肺癌治療的靶基因提供理論依據(jù)。
　　 3.FeCl3促進肺癌細胞A549增殖、抑制凋亡，同時，F(xiàn)n表達升高，下調(diào)Tf、IRP2、TfR表達；鐵螯合劑DFO則促進凋亡、抑制其生長，引起Fn表達下降，上調(diào)Tf、IRP2、TfR表達。這一發(fā)現(xiàn)不但解釋了肺癌患者多數(shù)在診斷時已處于貧血狀態(tài)的原因，同時也為如何處理患者的貧血狀態(tài)提供依據(jù)，再者對高鐵環(huán)境作業(yè)的防護具有重要指導(dǎo)價值。
　　 4.鐵增強A549細胞