近視眼發(fā)病機制的研究——視黃酸對鞏膜成纖維細胞基因表達的影響.pdf

1、近視是最普遍的屈光不正，人群中有著很高的發(fā)病率，其患病率各國報道不一。在北美、歐洲和澳大利亞人群中發(fā)病率為20-30％，據(jù)報道在東南亞地區(qū)的發(fā)病率高達80％。近視的主要損害在于眼球增大進而引起脈絡膜視網(wǎng)膜的病理性改變，如脈絡膜視網(wǎng)膜變性，視網(wǎng)膜脫離等。超過90％的高度近視患者有眼球病理的改變。因此在發(fā)達國家中，它成為致盲的首要原因之一。近視眼作為一個全球性的醫(yī)學和社會問題，已引起更多人的關注。目前還沒有任何一種方法能夠明確地顯示可延緩近

2、視的發(fā)展。歸根結(jié)底是因為近視的發(fā)病機制不清，難以找到有效的方法來治療，所以探討近視的發(fā)病機制對近視眼的防治具有重要的意義。 近期的研究表明眼球的大小和形狀是由鞏膜在生長過程中的功能形成的，鞏膜的重塑在近視的發(fā)展中是一個內(nèi)在的特征，鞏膜生化的改變是其質(zhì)變的前提，最終可導致近視的發(fā)展。視黃酸在眼球發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，參與了視覺引導的眼球生長。最近的研究發(fā)現(xiàn)視黃酸在視網(wǎng)膜、脈絡膜上均能合成和分泌，且能影響鞏膜的代謝。而視黃酸是

3、通過什么途徑最后對鞏膜發(fā)生作用，由此引起鞏膜細胞和基質(zhì)的變化機制目前尚不清楚。因此，從分子和基因水平探討視黃酸在人鞏膜細胞的作用將為近視眼發(fā)病機制的研究提供可靠的理論根據(jù)，對近視眼的防治具有重要的意義。 第一部分透鏡誘導豚鼠屈光不正的實驗研究 目的：觀察凹透鏡和凸透鏡對豚鼠眼球生長和屈光變化的影響，建立透鏡誘導型屈光不正動物模型，探討CRALBP在實驗性近視眼鞏膜中的作用。 方法：3～4周齡有色豚鼠47只，隨機分

4、成7組，右眼分別戴不同度數(shù)的凸或凹透鏡，其左眼作為對照眼，戴鏡前和戴鏡后第11天分別測量其眼軸長度、屈光度，觀察其變化。用HE染色測量誘導近視眼鞏膜和對照眼鞏膜的厚度變化。通過免疫組化和蛋白質(zhì)免疫印跡的方法檢測CRALBP在豚鼠誘導近視眼和對照眼的視網(wǎng)膜、脈絡膜和鞏膜的表達。 結(jié)果：戴鏡后第11天，與戴鏡前相比，戴+4.00D、+8.00D組的豚鼠眼分別增加了+1.46D與+1.58D的相對遠視(P＜0.05)；戴-4.00D、

5、-8.00D、-15.00D組的豚鼠分別增加了-2.92D、-3.17D、-3.10D的相對近視(P＜0.01)；而戴0.00D、-2.00D組的豚鼠的屈光度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。所有七組豚鼠的眼軸長度在實驗眼和對照眼之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。分別將對照眼和透鏡誘導近視眼后極部鞏膜HE染色，結(jié)果顯示誘導近視眼鞏膜比對照眼鞏膜變薄。免疫組化結(jié)果顯示，和對照眼相比，誘導近視眼的CRALBP在脈絡膜和鞏膜中的表達明顯降

6、低，在視網(wǎng)膜中的表達升高。Westernblotting結(jié)果和免疫組化結(jié)果相對應，CRALBP在誘導近視眼鞏膜中的表達明顯降低。 結(jié)論：豚鼠眼球生長發(fā)育受透鏡影響，可被用來建立一種簡單經(jīng)濟的屈光不正動物模型。和對照眼相比較，誘導近視眼鞏膜變薄。CRALBP在眼球發(fā)育以及近視眼形成過程中可能參與了RA的轉(zhuǎn)運與調(diào)節(jié)。 第二部分視黃酸對體外人鞏膜成纖維細胞影響的研究 目的：探討全反式視黃酸(all-transretin

7、oicacidat-RA)對培養(yǎng)的人鞏膜成纖維細胞(humanscleralfibroblastsHSF)的形態(tài)、增殖以及細胞周期的影響，從而探討at-RA在近視眼鞏膜重塑中的作用。 方法：HSF傳代至第四代后以1×105/孔的密度接種于96孔板或以1×106的密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，以含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，當細胞長滿瓶子80％～90％時，培養(yǎng)液轉(zhuǎn)換為含濃度為5×10-6M、1×10-5M、2×10-

8、5M，5×10-5Mat-RA的DMEM/F12。以未加RA組作正常對照，于12、24、48、72小時后觀察HSF形態(tài)；96孔板以濃度1×10-4M，1×10-5M，1×10-6M，1×10-7M，1×10-8Mat-RA作用HSF24、48、72小時后用MTT法測定其增殖情況；以濃度5×10-6M、1×10-5的at-PA作用于HSF，24、48小時后用FCM檢測細胞周期情況。 結(jié)果：不同at-RA的劑量對HSF的形態(tài)、增殖有

9、程度不同的負性影響。At-RA刺激后HSF細胞數(shù)目減少，細胞收縮，突起減少，部分裂解，胞漿內(nèi)有空泡和顆粒形成，細胞之間的間隙增寬，細胞變得細長，呈束狀或不規(guī)則排列。在高濃度(1×10-4M)時，細胞大部分裂解，看不到完整的細胞存在，只有裂解的碎片。MTT法顯示at-RA對鞏膜成纖維細胞有明顯的抑制作用，該效應呈劑量依賴性反應。FCM結(jié)果顯示經(jīng)at-RA刺激HSF24、48小時后，和對照組比較，隨著at-RA濃度和時間的增加，G0/G1期

10、細胞的比例逐漸上升，而S期和G2期細胞比例相應下降，細胞被阻滯在G0/G1期。 結(jié)論：RA可以抑制體外培養(yǎng)的人鞏膜成纖維細胞增殖和DNA合成，RA的濃度變化最終引起鞏膜成纖維細胞形態(tài)和功能的改變。RA可能是近視發(fā)生過程中的信使物質(zhì)。 第三部分視黃酸對人鞏膜成纖維細胞中CRABP、CRALBP、MMP-9和TIMP-1表達的影響 目的：利用基因芯片技術篩選RA培養(yǎng)HSF后相關基因群的表達變化，以探討RA作用于HSF

11、的相關通路。用不同濃度RA培養(yǎng)HSF后，HSF表達CPABP、CRALBP、MMP-9和TIMP-1的變化，以從分子水平解釋RA的作用機制。 方法：HSF傳代至第四代后以1×106的密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，以含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時后，培養(yǎng)液轉(zhuǎn)換為含濃度為1×10-5MRA的DMEM/F12，以未加RA組作正常對照，繼續(xù)培養(yǎng)48后用Trizol一步法提取細胞中的總RNA，對樣品RNA進行熒光標記，

12、通過雜交與清洗，對標記的人類全基因組寡核苷酸芯片進行掃描，采用圖像分析軟件對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，然后對芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進行歸一化，最后以差異為兩倍的標準來確定差異表達基因。將細胞以103～106傳代到25cm2培養(yǎng)瓶，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，加入含不同濃度RA的DMEM/F12，以單純加入DMEM/F12組做對照，培養(yǎng)48小時?；蛘邔⒓毎靡让赶笠?04傳代到六孔板中，進行細胞爬片培養(yǎng)24小時

13、后，同樣加入含濃度為1×10-5MRA的DMEM/F12，以單純加入DMEM/F12組做對照，培養(yǎng)48小時。采用RT-PCR法檢測每組細胞中CPABP-1mRNA和CPABP-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平；應用免疫細胞化學和熒光免疫細胞化學方法檢測CRABP-1、CPALBP、MMP-9、TIMP-1抗體在兩組細胞中的表達；用Westernblotting方法檢測兩組細胞中CRABP-1、CPALBP、MMP-9、TIMP-1蛋白的表達。

14、 結(jié)果：在用2×10-5RA刺激HSF48小時后，人類全基因組寡核苷酸芯片的21571個基因共有562個基因表達有差異。其中運輸36、轉(zhuǎn)錄調(diào)控30、信號60、逆境反應25、代謝133、發(fā)育67、細胞組織與生物發(fā)生15、細胞運動18、分化3、細胞周期25、細胞粘連31、細胞凋亡15個基因表達有差異。用不同濃度RA培養(yǎng)HSF后，和對照組比較，CPABP-1mRNA水平?jīng)]有明顯變化，而CRABP-2mRNA水平在刺激24小時后有輕微降低，但4

15、8小時后則明顯降低。免疫細胞化學、熒光免疫細胞化學和Westernblotting顯示CRABP-1和CRALBP在RA刺激HSF細胞后，表達輕微降低，MMP-9表達基本無變化而TIMP-1表達輕微降低。 結(jié)論：基因芯片對于研究RA對HSF影響的基因篩選快速有效，可同時發(fā)現(xiàn)多條基因通路變化。視黃酸結(jié)合蛋白在RA抑制HSF活性中發(fā)揮了一定的作用；MMPs及TIMPs參與了HSF的ECM的重塑；它們在近視眼的形成與發(fā)展中起了重要的作