eNOS-NO上調(diào)PGC-1α發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制研究及丁基苯酞在其中的作用.pdf

1、目的：以大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(SVAREC)作為研究對象，進(jìn)一步探討NBP發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。觀察糖氧剝奪/復(fù)氧(OGD/R)條件下，作為獨(dú)立于缺氧誘導(dǎo)因子HIF外的另一種促進(jìn)血管增生的因子PGC-1α及其下游VEGF表達(dá)水平的變化，探討其可能的調(diào)控機(jī)制。并且進(jìn)一步觀察NBP作用前后，內(nèi)皮細(xì)胞活性變化、抗氧化損傷能力的改變、核損傷情況、以及細(xì)胞內(nèi)PGC-1α、VEGF表達(dá)水平的變化等。擬初步探討NBP在OGD/R條件下發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用

2、的具體機(jī)制，是否與保護(hù)eNOS、上調(diào)PGC-1α有關(guān)。以尋找NBP血管保護(hù)作用的具體靶點(diǎn)，更好地為缺血性腦血管病的治療提供理論依據(jù)。 方法：⑴首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用免疫熒光和Western—Blot的方法，觀察NBP是否能增加OGD/R條件下內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)；從而在細(xì)胞模型上驗(yàn)證其在大體模型上已經(jīng)觀察到的促血管增生現(xiàn)象。⑵機(jī)制探討：實(shí)驗(yàn)中采用特異性的eNOS激動(dòng)劑CaI和抑制劑L—NIO，分別促進(jìn)和降低eNOS活性；用免疫

3、熒光和Western—Blot的方法檢測正常和OGD/R條件下內(nèi)皮細(xì)胞中PGC-1α、VEGF表達(dá)水平的變化；從而證明eNOS—NO是否參與內(nèi)皮細(xì)胞PGC-1α上游的表達(dá)調(diào)控。⑶采用特異性的eNOS激動(dòng)劑CaI和抑制劑L—NIO，分別促進(jìn)和降低OGD/R條件下 eNOS活性，采用Western—Blot的方法，觀察NBP是否通過eNOS—NO對OGD/R條件下PGC-1α、VEGF的表達(dá)產(chǎn)生影響。⑷用MTT的方法檢測細(xì)胞活性、測定OGD

4、/R后細(xì)胞SOD酶活性的變化、以及核染色的方法驗(yàn)證NBP是否通過eNOS對OGD/R條件下內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。 結(jié)果：①免疫熒光及WB的結(jié)果均表明，NBP1.0μM能明顯增加正常及OGD6h/R12h后內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)。運(yùn)用IPP圖像處理軟件，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以得出這種增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②從熒光圖片上可以看到，PGC-1α這種轉(zhuǎn)錄激活因子主要在胞核內(nèi)表達(dá)。外源性的NO donor SNAP并未使PGC-1α表達(dá)增高

5、；而特異性eNOS抑制劑卻能減低正常細(xì)胞中PGC-1α的表達(dá)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WB分析蛋白水平我們也得到類似的結(jié)果；說明eNOS—NO對正常內(nèi)皮細(xì)胞中PGC-1α的表達(dá)至關(guān)重要。WB還發(fā)現(xiàn)PGC-1α下游的VEGF也存在著類似的變化趨勢；即eNOS—NO對正常內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)亦至關(guān)重要。③WB的結(jié)果表明，OGD6h/R12h后PGC-1α表達(dá)增高，使用了eNOS激動(dòng)劑之后這種增高更加明顯；而使用eNOS抑制劑之后，PGC-1

6、α水平降至正常以下。其下游的VEGF也存在著同樣的變化趨勢。說明eNOS—NO能上調(diào)OGD/R條件下內(nèi)皮細(xì)胞中PGC-1α、VEGF的表達(dá)。④WB的方法我們發(fā)現(xiàn)，NBP能使OGD/R條件下增高的PGC-1α表達(dá)進(jìn)一步增多；具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而這種促進(jìn)作用在用了eNOS抑制劑之后有所減低?？梢钥闯鯪BP正是通過eNOS而起到上調(diào)PGC-1α的作用的。其下游的VEGF亦存在著類似的變化趨勢。⑤OGD6h/R12h后內(nèi)皮細(xì)胞SOD酶活性明顯降低

7、(約56％)；而用了NBP之后能很好的保護(hù)酶活性(上升約44.2％)；但這種保護(hù)作用在用了eNOS抑制劑之后消失。說明NBP抗氧化損傷的能力部分與eNOS相關(guān)。⑥OGD/R之后內(nèi)皮細(xì)胞活性(MTT值)明顯下降(約55％)；而NBP能使細(xì)胞活性上升約26％；同樣的這種保護(hù)作用在運(yùn)用了eNOS抑制劑之后減低(約23％)。⑦核染色的熒光圖片上可以看到：正常細(xì)胞核圓形或類圓形、邊界整齊、染色均勻。而OGD/R之后，胞核皺縮、核邊界不整、核碎裂增

8、多、染色濃染或聚集。加入了NBP之后能明顯減輕這種核損傷改變。eNOS抑制劑則使NBP的保護(hù)作用消失。這種變化趨勢具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：⑾在體外內(nèi)皮細(xì)胞模型上證明了NBP能上調(diào)OGD/R條件下血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，促進(jìn)血管增生。⑵內(nèi)源性eNOS—NO對正常內(nèi)皮細(xì)胞PGC-1α、VEGF的表達(dá)至關(guān)重要；并在OGD/R條件下能上調(diào)兩者的表達(dá)。⑶NBP通過保護(hù)eNOS，上調(diào)OGD/R條件下PGC-1α、VEGF的表達(dá)，