河蟹血細(xì)胞中螺原體侵染相關(guān)蛋白篩選及Rab7、14-3-3蛋白功能研究.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹，是一種重要的淡水養(yǎng)殖種類，在我國的淡水養(yǎng)殖業(yè)中占有很大的比重。目前，在中國江蘇省河蟹養(yǎng)殖是一個(gè)快速發(fā)展的行業(yè)，每年的產(chǎn)值在40億美元左右。然而，隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大及集約化程度的提高，一些由細(xì)菌、病毒和寄生蟲引起的疾病嚴(yán)重阻礙了河蟹養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。中華絨螯蟹顫抖病就是其中最嚴(yán)重的病害之一，而中華絨螯蟹螺原體（Spiroplasma erioche

2、iris）是引發(fā)該病的一種新型病原微生物。前期的研究證實(shí)，該病原主要通過河蟹的鰓或者體表進(jìn)入到宿主的體內(nèi)，并首先侵染其靶細(xì)胞—血細(xì)胞，在血細(xì)胞中大量繁殖并伴隨著血液循環(huán)進(jìn)而侵染河蟹的神經(jīng)、肌肉等組織，最終引起河蟹附肢的顫抖并最終導(dǎo)致宿主死亡。河蟹血細(xì)胞作為該病原重要的靶細(xì)胞，其必定在宿主對(duì)該病原的免疫中發(fā)揮重要的作用，因此，探究螺原體侵染河蟹血細(xì)胞的機(jī)制以及河蟹的免疫防御機(jī)制，對(duì)減少該病原對(duì)河蟹養(yǎng)殖業(yè)的危害具有重要的意義。本碩士學(xué)位論文

3、在目前已有的研究基礎(chǔ)上，首先，通過相對(duì)定量和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（isobaric tags forrelative and absolute quantization iTRAQ）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)，篩選中華絨螯蟹螺原體感染10天后河蟹血細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析該病原可能存在的侵染機(jī)制以及宿主對(duì)該病原免疫防御機(jī)制。其次，通過分析差異表達(dá)蛋白，挑選兩種蛋白（Rab7和14-3-3）通過基因克隆

4、、蛋白表達(dá)、抗體制備等，進(jìn)一步研究這兩種蛋白在病原的侵染和宿主的免疫機(jī)制當(dāng)中發(fā)揮的作用。本論文為進(jìn)一步探究中華絨螯蟹螺原體侵染河蟹的分子機(jī)制以及河蟹的免疫機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步減少螺原體對(duì)河蟹養(yǎng)殖業(yè)的危害提供理論依據(jù)，該論文主要從以下三個(gè)方面來開展研究:
　　1.iTRAQ篩選螺原體感染前后中華絨螯蟹血細(xì)胞的差異蛋白
　　本實(shí)驗(yàn)通過iTRAQ技術(shù)篩選螺原體感染前后河蟹血細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白，初步鑒定這些蛋白，根據(jù)功能分

5、為免疫相關(guān)蛋白、生理相關(guān)蛋白以及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白等等。本實(shí)驗(yàn)選擇差異倍數(shù)≥1.2的蛋白進(jìn)行功能分析，實(shí)驗(yàn)中篩選出來的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白（上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白）一共有76種。其中上調(diào)蛋白有35種，下調(diào)蛋白有41種，在這些差異表達(dá)的蛋白中大約有20種是與免疫相關(guān)的蛋白。上調(diào)蛋白包括谷胱甘肽轉(zhuǎn)氨酶(prostaglandin D synthase，GST)，鐵蛋白(ferritin)和熱休克60(heat shock protein60，

6、HSP60)等。下調(diào)蛋白包括兩種凝集素蛋白(mannosebinding protein and hemocytin)、三種絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白(two serpins and pacifastin)、三種不同的絲氨酸蛋白酶等等。選擇其中的8種蛋白(a2M,GST, ferritin,tubulin,crustin,thioredoxin,clip domain serine proteaseand serpin)，通過實(shí)時(shí)定量PCR

7、(qRT-PCR)的方法檢測其對(duì)應(yīng)蛋白在基因水平的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明除了tubulin其余的結(jié)果都與iTRAQ篩選結(jié)果基本保持一致。
　　2.Rab7基因克隆、蛋白原核表達(dá)及相關(guān)功能研究
　　Rab7屬于小G蛋白家族中的一種，近期的研究表明Rab蛋白在甲殼類的先天性免疫當(dāng)中發(fā)揮著重要作用。本研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證iTRAQ篩選的Rab7蛋白表達(dá)變化以及進(jìn)一步揭示該蛋白在河蟹的免疫反應(yīng)當(dāng)中發(fā)揮的作用。本實(shí)驗(yàn)首先通過RACE技術(shù)擴(kuò)增

8、了Rab7的基因全長，并成功在體外完成原核表達(dá)、純化以及多克隆抗體的制備。qRT-PCR檢測在螺原體的感染下Rab7 mRNA表達(dá)變化，通過Western blot技術(shù)檢測在螺原體的感染下河蟹血細(xì)胞當(dāng)中Rab7蛋白的表達(dá)，其結(jié)果與iTRQA基本一致。這一結(jié)果進(jìn)一步說明了Rab7在河蟹應(yīng)對(duì)螺原體的感染中發(fā)揮重要作用。
　　3.14-3-3基因克隆、蛋白原核表達(dá)及相關(guān)功能研究
　　14-3-3蛋白是一類酸性可溶性蛋白并且在真核生

9、物中有著廣泛的分布，最近的研究表明14-3-3蛋白在甲殼類的先天性免疫過程當(dāng)中發(fā)揮重要作用。本研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證iTRAQ中得到的14-3-3蛋白的表達(dá)變化并進(jìn)一步揭示該蛋白在河蟹的免疫反應(yīng)當(dāng)中的作用。首先，通過PCR技術(shù)克隆14-3-3的基因，并對(duì)序列進(jìn)行分析。其次，成功在體外完成該蛋白的原核表達(dá)，純化以及多克隆抗體的制各純化。qRT-PCR技術(shù)檢測在螺原體的感染下14-3-3 mRNA的表達(dá)變化，通過Western blot檢測該蛋