伴13號(hào)染色體缺失的多發(fā)性骨髓癌患者CD138+細(xì)胞差異表達(dá)microRNAs的篩選.pdf

1、目的：
　　 ①研究多發(fā)性骨髓瘤(MM)常見的染色體異常及其與療效的關(guān)系。
　　 ②篩選13號(hào)染色體缺失陽(yáng)性與陰性的MM患者骨髓瘤細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs，尋找與MM13號(hào)染色體缺失相關(guān)的分子標(biāo)記。
　　 ③預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNAs的潛在靶基因及靶基因富集的生物學(xué)通路，進(jìn)一步探討miRNAs在伴13號(hào)染色體缺失的MM中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 ①收集標(biāo)本:實(shí)驗(yàn)組選取多發(fā)性骨髓瘤初治患者

2、29例（男∶女=20∶9），中位年齡60(46-83)歲。采集患者新鮮骨髓標(biāo)本，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠法分選CD138+細(xì)胞。對(duì)照組選取健康對(duì)照10例。
　　 ②FISH實(shí)驗(yàn):選用P53、RB1、D13S319、IgH和1q215種探針，通過熒光原位雜交(FISH)實(shí)驗(yàn)對(duì)29例多發(fā)性骨髓瘤初治患者進(jìn)行染色體異常檢測(cè)。
　　 ③療效分析:對(duì)接受化療的患者隨訪2個(gè)療程，療效判定參考?xì)W洲血液和骨髓移植協(xié)作組EB

3、MT療效標(biāo)準(zhǔn)，以患者達(dá)到輕微反應(yīng)(MR)以上為治療有效，分析患者染色體異常與療效之間的關(guān)系。
　　 ④miRNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)及RT-PCR驗(yàn)證:篩選出3例RB1及D13S319探針信號(hào)陽(yáng)性，而IgH、p53和1q21探針信號(hào)陰性的患者定為13q-陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組;另選出3例5種探針信號(hào)均為陰性的患者作為13q-陰性對(duì)照組;提取總RNA并進(jìn)行質(zhì)量鑒定;使用mirVanaTM RNA分離試劑盒分離并富集miRNAs; Cy3熒光基團(tuán)標(biāo)記

4、miRNAs; RNeasy Mini試劑盒對(duì)標(biāo)記的miRNAs進(jìn)行純化;與miRNA表達(dá)譜芯片進(jìn)行芯片雜交;芯片掃描儀掃描，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析獲得差異表達(dá)miRNAs;采用莖環(huán)RT-PCR對(duì)miRNA芯片結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。
　　 ⑤生物信息學(xué)分析:應(yīng)用對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析;應(yīng)用在線軟件預(yù)測(cè)差異miRNAs的潛在靶基因;對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO及KEGG分析;整合miRNAs與預(yù)測(cè)靶基因之間的調(diào)控，利用HPRD數(shù)據(jù)庫(kù)建立m

5、iRNAs與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　 結(jié)果：
　　 1.FISH實(shí)驗(yàn)
　　 ①29例MM患者中RB1缺失、D13S319缺失、IgH易位、1q21擴(kuò)增、p53缺失的患者分別占48.3％、44.8％、48.3％、24.1％、10.3％;5種探針均為陽(yáng)性的患者1例(3.4％);5種探針均為陰性的患者3例(10.3％);13q-的患者（RB1或D13S319探針陽(yáng)性）的患者15例(51.7％);存在13q-的患者中有8

6、例(27.6％)伴有IgH易位。
　　 ②療效分析:23例完整隨訪2個(gè)療程的患者中，有15例達(dá)到了MR以上的療效，總反應(yīng)率為65.2％;其中應(yīng)用含硼替佐米的聯(lián)合化療方案的反應(yīng)率為83.3％(5/6)，應(yīng)用地塞米松為主的化療方案的反應(yīng)率為58.8％(10/17)，兩者比較差異無(wú)顯著性;存在13q缺失、IgH易位的患者總治療反應(yīng)率分別為57.1％(8/14)，58.3％(7/12)，與其相應(yīng)陰性組比較差異無(wú)顯著性;應(yīng)用硼替佐米的6例

7、患者中，13q-陽(yáng)性組反應(yīng)率為100％(3/3)，13q-陰性組反應(yīng)率為66.7％(2/3)，IgH易位陽(yáng)性組反應(yīng)率為100％(2/2)，無(wú)效組反應(yīng)率為75％(3/4)，13q-、IgH易位陽(yáng)性組與陰性組間差異無(wú)顯著性。
　　 2.miRNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn):篩選出3例RB1及D13S319探針信號(hào)陽(yáng)性，而IgH、p53和1q21探針信號(hào)陰性的患者定為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組;另選出3例5種探針信號(hào)均為陰性的患者作為陰性對(duì)照組，進(jìn)行miRNA芯

8、片檢測(cè)。共檢測(cè)出5個(gè)差異表達(dá)miRNAs，其中其中4個(gè)表達(dá)下調(diào)，1個(gè)表達(dá)上調(diào)。聚類分析顯示，5個(gè)差異表達(dá)的miRNAs可以將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組區(qū)分開。熒光定量RT-PCR驗(yàn)證示5種miRNAs表達(dá)情況與芯片結(jié)果一致。
　　 4.靶基因預(yù)測(cè)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò):5種miRNAs預(yù)測(cè)的靶基因數(shù)目最多者為miR-424，最少者為miR-3679-5p;通過生物信息學(xué)分析構(gòu)建了miRNAs-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并得到一系列在網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的靶基因，其

9、中SMAD3節(jié)點(diǎn)度最高，提示該基因可能在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有較高生物學(xué)意義。
　　 結(jié)論：免疫磁珠分選+FISH技術(shù)是一種檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤染色體異常的敏感方法。由于樣本量較少，本研究未發(fā)現(xiàn)染色體異常與療效之間的相關(guān)性。伴13號(hào)染色體缺失的MM患者骨髓瘤細(xì)胞中存在差異表達(dá)的miRNAs，提示miRNAs可能參與了該異常核型MM的發(fā)生發(fā)展。miR-424所預(yù)測(cè)的靶基因SMAD3及其參與的TGF-β/Smad3信號(hào)通路可能是差異表達(dá)的mi