Akt-eNOS信號通路在EPO促進慢性缺氧心肌細(xì)胞線粒體生物合成中作用的實驗研究.pdf

1、背景:紫紺型先天性心臟病仍舊嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。慢性缺氧是這類病人的共同病理生理過程，但心肌細(xì)胞的慢性缺氧機制尚不完全清楚。
　　在缺氧時EPO受HIF-1α的調(diào)節(jié)分泌增加，以往認(rèn)為EPO水平升高，主要是通過其造血作用進而增加循環(huán)血液中成熟紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量，提高血液攜氧能力應(yīng)對缺氧。但近期發(fā)現(xiàn)，EPOR能夠表達(dá)于包括心肌在內(nèi)的多種非造血組織，EPO可以通過作用于心肌EPOR產(chǎn)生不依賴造血的直接效應(yīng)，顯著減輕有害應(yīng)激如

2、缺血、缺氧所導(dǎo)致的心肌損傷，但其機制尚不清楚。Akt是EPO/EPOR信號通路下游重要的信號分子之一，而eNOS(endothelialnitricoxidesynthase，內(nèi)皮型一氧化氮合酶)作為Akt的下游信號，可以調(diào)節(jié)NO(nitricoxide，一氧化氮)的合成進而調(diào)節(jié)線粒體生物合成。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)紫紺型先心病患者心肌EPOR蛋白較非紫紺型先心病患者表達(dá)增加，提示慢性缺氧心肌EPO/EPOR信號增強。因此，我們推測:慢性缺

3、氧條件下，EPO與EPOR結(jié)合后，可能通過激活其下游Akt/eNOS通路參與了線粒體生物合成作用，從而參與了心肌慢性缺氧適應(yīng)。
　　目的:
　　觀察EPO在慢性缺氧條件下對心肌線粒體生物合成的影響及其可能的機制。
　　方法:
　　1.觀察EPO對慢性缺氧心肌細(xì)胞線粒體生物合成的影響將H9c2細(xì)胞株置入缺氧培養(yǎng)箱(94％N2，5％CO2，1％O2)，培養(yǎng)1周后建立慢性缺氧模型;采用不同濃度的rhEPO(recomb

4、inanthumanerythropoietin;重組人促紅細(xì)胞生成素)對缺氧培養(yǎng)H9c2細(xì)胞株進行干預(yù)處理，未經(jīng)rhEPO處理的慢性缺氧細(xì)胞組為空白對照;用熒光探針標(biāo)記線粒體，觀察線粒體數(shù)目的變化;RT-PCR技術(shù)檢測線粒體DNA的相對拷貝數(shù)變化;Westernblot技術(shù)檢測Akt、eNOS及其磷酸化蛋白水平的變化。
　　2.觀察Akt/eNOS信號通路的介導(dǎo)作用Wortmannin為Akt磷酸化的特異性阻斷劑;向慢性缺氧培養(yǎng)

5、的心肌細(xì)胞細(xì)胞株內(nèi)分別加入20U/mLrhEPO，20U/mLrhEPO+Wortmannin100nmol/mL，檢測Akt、P-Akt、eNOS、P-eNOS蛋白水平的變化及線粒體拷貝數(shù)的變化;構(gòu)建shRNA質(zhì)粒，將帶有熒光蛋白標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至慢性缺氧心肌細(xì)胞株;一組質(zhì)粒中帶有eNOS基因干擾片段，另一組空載體質(zhì)粒設(shè)為陰性對照;將兩組細(xì)胞株經(jīng)rhEPO20U/mL處理后，檢測eNOS、P-eNOS蛋白表達(dá)水平并觀察線粒體拷貝數(shù)的變化

6、。
　　結(jié)果:
　　1.rhEPO干預(yù)后慢性缺氧心肌細(xì)胞株線粒體數(shù)目及拷貝數(shù)增加(P＜0.05)，Akt、eNOS蛋白磷酸化水平增強(P＜0.05)，Akt、eNOS總蛋白無明顯變化(P＞0.05);
　　2.特異性阻斷Akt磷酸化后，Akt、eNOS磷酸化水平較未阻斷組均減弱(P＜0.05)，總蛋白濃度無差異(P＞0.05);線粒體拷貝數(shù)較未阻斷組亦減少(P＜0.05);shRNA干擾eNOS表達(dá)后，eNOS及P-e