NO信號通路在慢性缺氧心肌線粒體生物合成中的調(diào)控機制研究.pdf

1、背景與目的：心肌慢性缺氧是臨床常見的病理生理過程,可導致心肌產(chǎn)生一系列代謝適應(yīng)性改變,與線粒體的數(shù)量和功能密切相關(guān)的線粒體生物合成過程的適應(yīng)性改變可能是其中重要的環(huán)節(jié),但慢性缺氧對心肌線粒體生物合成影響的機制目前尚不完全清楚。一氧化氮(NO)可能參與了多種細胞線粒體生物合成的調(diào)控,其在慢性缺氧心肌線粒體生物合成中的作用尚不明了。深入研究NO與慢性缺氧心肌線粒體的適應(yīng)性改變和調(diào)控之間的關(guān)系,將有望闡明缺氧狀態(tài)下心肌的病理生理改變機制,為進

2、一步增強缺氧狀態(tài)下的心肌保護,提高臨床治療效果提供新的思路。本課題分別在先天性心臟病心肌組織標本和體外培養(yǎng)慢性缺氧心肌細胞模型上,對心肌細胞的線粒體生物合成和NO信號通路變化進行形態(tài)學和分子生物學研究,探討NO在慢性缺氧狀態(tài)下對心肌線粒體生物合成的調(diào)控作用機制。 研究方法：本研究共分為三部分: 第一部分:選取紫紺型和非紫紺型先天性心臟病患者各10例,留取手術(shù)中切除的肥厚右室流出道組織,通過電鏡觀察分析標本心肌細胞超微結(jié)構(gòu),運用實

3、時熒光PCR、RT-PCR及Western blot等方法比較心肌組織mtDNA拷貝數(shù),細胞色素c氧化酶I (COX I)、過氧化物酶體增生物激活受體γ輔激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Tfam)和三型NOS的mRNA或(和)蛋白水平,檢測NOS酶活性,并對PGC-1α、eNOS蛋白水平與患者末梢血氧飽和度SaO2進行相關(guān)性分析。第二部分:體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞,根據(jù)不同干預因素將心肌細胞分為對

4、照組,NO供體SNAP組,SNAP+NO清除劑氧合血紅蛋白(OxyHb)組及SNAP+可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)抑制劑(ODQ)組。應(yīng)用線粒體熒光探針在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組細胞線粒體量的變化,應(yīng)用實時熒光PCR、RT- PCR及Western blot等方法分別比較各組細胞mtDNA拷貝數(shù),COX I、PGC-1α、NRF1和Tfam的mRNA水平以及COXI蛋白水平等。第三部分:通過1％O2濃度培養(yǎng)48小時建立體外培養(yǎng)乳鼠心肌

5、細胞慢性缺氧模型,根據(jù)不同干預方式將心肌細胞分為對照組,慢性缺氧組,慢性缺氧+NOS抑制劑L-NAME組,慢性缺氧+OxyHb組以及慢性缺氧+ODQ組。檢測細胞培養(yǎng)液上清NO濃度和心肌細胞NOS蛋白水平,應(yīng)用線粒體熒光探針觀察各組細胞線粒體量的變化,應(yīng)用實時熒光PCR、RT- PCR及Western blot等方法分別比較各組細胞mtDNA拷貝數(shù),COX I、PGC-1α、NRF1和Tfam的mRNA水平以及COX I蛋白水平等。

6、 研究結(jié)果：本研究主要結(jié)果如下: 1.紫紺型先天性心臟病右室流出道心肌組織中線粒體體密度Vv、數(shù)密度Nv明顯高于非紫紺組(p0.05, p0.01),mtDNA拷貝數(shù)顯著高于非紫紺組(p0.01),COX I、PGC-1α、NRF1和Tfam的mRNA水平均顯著高于非紫紺組(p0.01),COX I、eNOS蛋白表達顯著高于非紫紺組(p0.05, p0.05),心肌組織PGC-1αmRNA水平與SaO2呈顯著的負相關(guān)(r=-0.75,

7、 p0.01),eNOS蛋白水平與SaO2呈顯著的負相關(guān)(r=-0.64, p0.01),PGC-1αmRNA水平與eNOS蛋白水平呈顯著的正相關(guān)(r=0.58, p0.01); 2. (1) NO供體SNAP干預組心肌細胞線粒體熒光強度、mtDNA拷貝數(shù)、COXI mRNA和蛋白水平均明顯高于對照組(p0.01, p0.01, p0.01, p0.01),與線粒體生物合成相關(guān)的信號分子PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA水平也高

8、于對照組(p0.01, p0.01, p0.05); (2)與SNAP組比較,SNAP+OxyHb組線粒體熒光強度、mtDNA拷貝數(shù)、COXI mRNA均降低(p0.01, p0.01, p0.05),PGC-1α和NRF1 mRNA水平也降低(p0.01, p0.05); (3)與SNAP組比較,SNAP+ODQ組線粒體熒光強度、mtDNA拷貝數(shù)和COXI mRNA水平均降低(p0.05, p0.01, p0.05),PGC-1αmR

9、NA水平也降低(p0.05); 3. (1)慢性缺氧心肌細胞培養(yǎng)液上清NO濃度明顯高于對照組(p0.01),iNOS和eNOS蛋白水平明顯高于對照組(p0.05, p0.05);慢性缺氧心肌細胞線粒體熒光強度、mtDNA拷貝數(shù)、COXI mRNA水平均明顯高于對照組(p0.01, p0.01, p0.01),與線粒體生物合成相關(guān)的信號分子PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA水平也高于對照組(p0.01, p0.05, p0.01)

10、; (2)與慢性缺氧組比較,慢性缺氧+ L-NAME組線粒體熒光強度、COXI mRNA和蛋白水平均降低(p0.01, p0.01, p0.05),PGC-1α和Tfam mRNA水平也降低(p0.05,p0.01); (3)與慢性缺氧組比較,慢性缺氧+ OxyHb組PGC-1αmRNA水平降低(p0.05),其它指標無明顯變化; (4)與慢性缺氧組比較,慢性缺氧+ODQ組線粒體熒光強度、mtDNA拷貝數(shù)、COXI mRNA和蛋白水平均

11、降低(p0.01, p0.05, p0.01, p0.05),PGC-1α和Tfam mRNA水平也降低(p0.01, p0.05)。 結(jié)論：本課題分別在先天性心臟病心肌組織標本和體外培養(yǎng)慢性缺氧心肌細胞模型上,對心肌細胞的線粒體生物合成和NO信號通路變化進行形態(tài)學和分子生物學研究,探討NO在慢性缺氧狀態(tài)下對心肌線粒體生物合成的調(diào)控作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 1.紫紺型先天性心臟病右室流出道心肌組織中線粒體數(shù)量增多, mtDNA拷貝數(shù)

12、增多,線粒體編碼的COXI蛋白mRNA和蛋白水平升高。說明紫紺型先天性心臟病心肌線粒體生物合成明顯增多;同時,紫紺型先天性心臟病右室流出道心肌組織中eNOS蛋白水平升高,并且與線粒體生物合成呈顯著的正相關(guān),提示其參與了線粒體生物合成的調(diào)節(jié); 2. NO供體在體外可以促進培養(yǎng)心肌細胞的線粒體生物合成,該過程可能通過sGC-cGMP途徑介導; 3.慢性缺氧的培養(yǎng)心肌細胞中iNOS和eNOS蛋白表達升高,NO合成增多,同時線粒體的生物合成上調(diào)