采前光照誘導抗氧化物積累抑制‘Anjou’梨果實虎皮病發(fā)生的生化及分子機制.pdf

1、虎皮病（Superficial scald）是影響‘Anjou’梨采后貯藏壽命的主要生理性病害，嚴重影響果實的外觀和商品價值?；⑵げ〉陌l(fā)生是某些梨和蘋果品種在貯藏之后出現(xiàn)的因表皮細胞氧化造成的棕褐色病變。一般認為α-法尼烯的氧化產(chǎn)物共軛三烯是造成表皮褐化，產(chǎn)生虎皮病的關鍵因素?；⑵げ〉陌l(fā)生受采前溫度、果實成熟度、采后貯藏溫度、氣調(diào)貯藏氣體比例、乙烯合成等多個因素的影響。在本研究中，前期試驗發(fā)現(xiàn)‘Anjou’梨果實著色面在八個月的長期貯藏

2、中也沒有虎皮病的發(fā)生，說明虎皮病的發(fā)生與采前光照有密切聯(lián)系。因此，闡明光照誘導果實著色和抑制虎皮病發(fā)生的分子機理對于梨和蘋果的采后貯藏意義重大。
　　本研究以綠‘Anjou’(Pyrus communis L. cv. d’Anjou’)為試材，利用套袋處理，去除采前光照的影響。首先比較了套袋處理對綠‘Anjou’梨乙烯、呼吸、果實硬度、α-法尼烯、共軛三烯和虎皮病發(fā)生的影響。研究結果表明遮光處理對果實貯藏期間的乙烯、呼吸和后熟性

3、狀沒有影響，顯著降低了可溶性固形物的含量；但是遮光處理明顯增加了α-法尼烯和共軛三烯的含量，促進了虎皮病的發(fā)生。進一步分析表明，α-法尼烯和共軛三烯僅在低溫貯藏過程中積累，在后熟過程中都呈下降的趨勢，由此說明，虎皮病的發(fā)生與低溫下α-法尼烯尤其是共軛三烯的積累量有關。
　　研究結果表明α-法尼烯在果實陽面和果實陰面中的含量相近，但共軛三烯的含量在果實陽面中明顯低于果實陰面。果實陽面中積累了豐富的抗氧化物質(zhì)（如花青素、多酚、類黃酮、

4、黃烷醇），從而導致總抗氧化性的提高，抑制了α-法尼烯向共軛三烯的氧化過程。另外，果實陽面中的SOD、MDAR、APX、DHAR、GR等抗氧化酶也明顯高于果實陰面，這些抗氧化酶使果實陽面具有更高的去除超氧陰離子自由基（O2-）、羥基自由基（-OH）、過氧化氫（H2O2）等自由基的能力。減輕了共軛三烯對果皮細胞的氧化傷害，從而減輕了虎皮病的發(fā)生。
　　為了進一步闡明虎皮病發(fā)生的分子機理，本文以綠‘Anjou’和紅‘Anjou’果實為試

5、材，克隆了兩個品種的α-法尼烯合成酶基因（AFS），命名為PcAFS1。cDNA全長1952 bp，編碼577個氨基酸，兩者同源性為99.3％。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，PcAFS1與蘋果α-法尼烯合成基因同源性最高。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，PcAFS1在‘Anjou’果實、幼葉、老葉、花中都有表達，但在成熟度高的果皮中表達量最高；并且受乙烯的誘導。在采后低溫貯藏過程中表達上升，1-MCP處理可以抑制該基因的表達?？寺”容^了兩個品種PcAFS1基

6、因的啟動子，啟動子序列全長2067 bp，同源性99.6%，兩者相差9個堿基。PLANTCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析了啟動子上的順式元件，發(fā)現(xiàn)PcAFS1的啟動子含有HSE（熱激響應原件）和MBS（MYB結合位點），說明該基因有可能受溫度和MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。為了進一步確定PcAFS1基因的功能，我們構建了pBI121-PcA

7、FS1過量表達載體，利用農(nóng)桿菌侵染法浸染擬南芥花序。分析了轉(zhuǎn)基因擬南芥的α-法尼烯積累，表明PcAFS1可以促進α-法尼烯合成。用乙烯（0.2μl l-1）處理轉(zhuǎn)基因擬南芥，α-法尼烯積累上升，并發(fā)現(xiàn)蓮座葉有向下彎曲的現(xiàn)象。
　　花青素在光照和套袋處理中差異最大，說明花青素可能在虎皮病的發(fā)生過程中發(fā)揮了關鍵作用。為了進一步確定花青素和虎皮病發(fā)生的分子機理，以綠‘Anjou’和紅‘Anjou’果皮為試材，利用差異篩選的方法，得到一個

8、表達差異極為顯著地花青素調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子，命名為PcMYB1。該基因只在紅‘Anjou’果皮中表達，在綠‘Anjou’沒有表達。在綠‘Anjou’和紅‘Anjou’果皮克隆了 PcMYB1的啟動子序列，比對發(fā)現(xiàn)兩者同源性達99.3%，只有12個堿基的差異；克隆了兩者的基因組序列，發(fā)現(xiàn)紅‘Anjou’與綠‘Anjou’相比，在第一個內(nèi)含子上缺失了244個堿基。推測是因為內(nèi)含子的缺失造成的基因轉(zhuǎn)錄水平的差異和造成綠‘Anjou’果實變紅。

9、
　　在果實貯藏前期，紅‘Anjou’中α-法尼烯的積累比綠‘Anjou’要高。1-MCP處理的紅‘Anjou’PcAFS1的基因表達在果實貯藏后期可以部分恢復，在綠‘Anjou’中完全被抑制。為了確定PcMYB1是否調(diào)控PcAFS1的基因表達，用35S::PcMYB1、35S::PcbHLH3、35S::PcWD40與PPcAFS1::LUC共轉(zhuǎn)化煙草葉片，發(fā)現(xiàn)PcMYB1促進PcAFS1的基因表達，但是這種促進作用不受花青素調(diào)

10、控因子bHLH或WD40的影響。說明PcMYB1對α-法尼烯的調(diào)控機制與花青素不同。
　　根據(jù)本研究的結果，我們對光照抑制‘Anjou’梨虎皮病的發(fā)生做了以下總結和推測：在生化層面，光照促進了花青素、多酚、類黃酮、黃烷醇等抗氧化物質(zhì)的積累，提高了SOD、MDAR、APX、DHAR、GR等抗氧化酶的活性，從而導致總抗氧化性的提高，抑制了α-法尼烯向共軛三烯的氧化過程，構成了果實陽面對虎皮病的天然抗性。在分子機理層面，PcMYB1在紅