HPS自然轉(zhuǎn)化方法的改進及HPS自轉(zhuǎn)運蛋白AT2、AT3的功能研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS）是健康豬上呼吸道的常在菌，在一定條件下侵入機體引發(fā)全身性疾病。本研究基于USS序列以及質(zhì)粒甲基化修飾對現(xiàn)有自然轉(zhuǎn)化方法進行改進，以提高現(xiàn)有自然轉(zhuǎn)化構(gòu)建缺失株的效率以及擴大轉(zhuǎn)化菌株范圍從而利于后續(xù)對HPS各基因的功能研究。自轉(zhuǎn)運蛋白可以抑制細胞的吞噬作用以及抵抗補體介導的殺傷，本研究以HPS自轉(zhuǎn)運蛋白AT2、AT3為研究對象，通過構(gòu)建其基因缺失株研究了AT2、AT3在HPS

2、抵抗宿主天然免疫方面的影響。主要研究內(nèi)容包括：
　?、艠?gòu)建重組質(zhì)粒。根據(jù)SH0165全基因組序列設(shè)計引物克隆at2、at3、htrA基因上下游同源臂及kanR、gmR抗性盒，通過重疊PCR將抗性表達盒連接到基因上下游同源臂之間，并在同源臂上游同源臂上游及下游同源臂下游添加USS序列得到重組片段。分別將重組片段連接pK18mobsacB和pSHK3質(zhì)粒載體，得到相應(yīng)重組質(zhì)粒。
　?、谱匀晦D(zhuǎn)化方法的改進與評價。用pK18mobs

3、acB和pSHK3為載體的重組質(zhì)粒pK3UK和pS3UK分別自然轉(zhuǎn)化HPS15種血清型參考菌株及地方分離株SH0165，嘗試使用穿梭載體是否能夠用于HPS的自然轉(zhuǎn)化并評價其轉(zhuǎn)化效率。隨后，將pS3UK電轉(zhuǎn)至HPS菌株，得到體內(nèi)甲基化的重組質(zhì)粒pS3UKm，將pS3UKm、pK3UK和pS3UK同時自然轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化到不同HPS菌株中，評價質(zhì)粒甲基化對HPS的自然轉(zhuǎn)化效率的影響。
　?、荂F7066△at2pd、△at3pd基因缺失株的構(gòu)

4、建及鑒定。將重組質(zhì)粒依次自然轉(zhuǎn)化到CF7066菌株，成功得到CF7066缺失株CF7066△at2pd∷ermR、CF7066△at3pd∷kanR、CF7066△at2pd∷ermR△at3pd∷kanR。缺失株以PCR、Southern blot以及RT-PCR鑒定，且測序正確。
　?、萢t2、at3基因功能研究。通過測定CF7066野生菌株及缺失株OD600-時間關(guān)系曲線，表明at2、at3的缺失對CF7066的生長趨勢沒有

5、顯著影響。血清抗性試驗表明at2、at3缺失后CF7066的抗血清殺傷能力提高。通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)缺失株中capD、galU、galE、ompP2等文獻報道HPS與粘附侵入、血清抗性相關(guān)的潛在毒力因子出現(xiàn)上調(diào)。此外，進行3D4/21對CF7066的吞噬試驗發(fā)現(xiàn)，at2、at3缺失后CF7066更容易被3D4/21所吞噬。
　?、裳芯堪l(fā)現(xiàn)并證實H.parasuis-E.coli穿梭載體pSHK3能夠用于HPS自然轉(zhuǎn)化構(gòu)建缺失株，