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文檔簡介
1、立題背景: 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是嬰幼兒最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤,約占兒童全身惡性腫瘤的4%,90%發(fā)生于3歲以前。據(jù)估計(jì),每年全世界有5000例(其中包括美國250~300例)RB新病例被確診,且近年來有上升趨勢。其惡性程度高,部分病例雙眼發(fā)病,對視力損害極大,并可危及生命。近年來,盡管RB的診斷和治療較以前都有了很大的提高,但其發(fā)生的具體機(jī)理仍不明確,難以達(dá)到根治的目的。為了解決這些問題,研究者進(jìn)行了大量的研究。與RB相關(guān)的許多動(dòng)物模
2、型主要是通過異種移植和轉(zhuǎn)基因兩種方式在前房、視網(wǎng)膜下或皮下接種瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的,這些動(dòng)物模型的建立為探討RB發(fā)生機(jī)理和治療方法提供了良好的工具,然而這些腫瘤模型卻面臨著成瘤率低的困擾,其原因尚不清楚。因此,探討裸鼠腫瘤模型成瘤率低的原因,并進(jìn)一步闡明裸鼠對抗腫瘤生長的相關(guān)機(jī)理,具有重要意義。 腫瘤細(xì)胞能否在體內(nèi)生長與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。目前,腫瘤免疫已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一。機(jī)體免疫系統(tǒng)識別腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤抗原產(chǎn)生免疫
3、應(yīng)答,引起效應(yīng)細(xì)胞的激活和釋放一系列效應(yīng)分子,攻擊和清除腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤的生長,同時(shí)也可能造成自身機(jī)體組織的損傷。這一應(yīng)答能否有效地產(chǎn)生,取決于腫瘤細(xì)胞抗原性的強(qiáng)弱和宿主的免疫功能,其中細(xì)胞免疫在機(jī)體與腫瘤細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮主導(dǎo)作用。在免疫功能正常的機(jī)體中,T淋巴細(xì)胞通過特異性識別腫瘤細(xì)胞,激活相關(guān)細(xì)胞因子,發(fā)揮特異性殺傷作用,這一經(jīng)典的免疫過程已被人們所共識。然而目前眾多的腫瘤動(dòng)物模型中使用的是裸小鼠,此鼠由于染色體等位基因發(fā)生突
4、變引起先天性胸腺發(fā)育不足,體內(nèi)缺乏成熟的T細(xì)胞,細(xì)胞免疫相對低下,推測特異性細(xì)胞免疫在裸鼠對抗腫瘤生長中不是決定性力量。但其內(nèi)的前T細(xì)胞及非特異性免疫細(xì)胞正常,可能在排斥瘤細(xì)胞過程中發(fā)揮一定作用。近年來,機(jī)體的非特異性免疫細(xì)胞,特別是中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞,在抗腫瘤中的作用及機(jī)制日益受到研究者的重視。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,NK細(xì)胞既可以通過“內(nèi)識別”方式直接與腫瘤細(xì)胞發(fā)生作用,也可以在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)
5、胞的作用下被激活而發(fā)生抗腫瘤的作用,但相關(guān)的具體機(jī)制到目前為止仍然不清楚。闡明非特異性免疫細(xì)胞等在機(jī)體抗腫瘤中的作用,為進(jìn)一步研究腫瘤發(fā)生機(jī)理和免疫治療提供依據(jù),是當(dāng)前腫瘤免疫學(xué)研究領(lǐng)域迫切需要解決的問題。 研究目的: 觀察SO—Rb50瘤細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)早期分布和成瘤情況,并探討裸小鼠對抗SO—Rb50瘤細(xì)胞生長的免疫學(xué)機(jī)制。 方法: 1.裸小鼠22只,經(jīng)尾靜脈接種SO—Rb50瘤細(xì)胞,其中4只裸小鼠接
6、種的SO—Rb50瘤細(xì)胞經(jīng)Dil染色標(biāo)記,運(yùn)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測檢Dil標(biāo)記的SO—Rb50瘤細(xì)胞在體內(nèi)主要臟器的早期分布及含量。2只接種瘤細(xì)胞裸小鼠于第7天被處死,HE形態(tài)學(xué)觀察各臟器有無病變形成。定期觀察其余裸小鼠的健康狀況及有無腫瘤形成,待其死亡時(shí)立即解剖,大體觀察各器官組織有無腫瘤形成,并取肝、脾、腎、肺、眼球和腦等臟器分別行形態(tài)學(xué)觀察,免疫組織化學(xué)法檢測MPO,CD56,CD68,CD3,CD20和CD79的表達(dá)??瞻?/p>
7、對照裸小鼠4只,經(jīng)尾靜脈注射無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)0.1ml。 2.裸鼠10只經(jīng)尾靜脈接種SO—Rb50瘤細(xì)胞,在不同時(shí)間點(diǎn)處死,運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞在不同臟器的含量。設(shè)空白對照裸小鼠2只。 結(jié)果: 1.裸鼠經(jīng)尾靜脈接種瘤細(xì)胞后,Dil標(biāo)記的SO—Rb50細(xì)胞早期主要分布在肝;脾、肺和外周血中也有少許發(fā)現(xiàn)。術(shù)后第二天對各臟器行熒光顯微鏡檢測,觀察到肝臟平均每個(gè)視野(100
8、×)Dil標(biāo)記的SO—Rb50細(xì)胞數(shù)為124±44.7,明顯高于脾27.5±12.92和肺3.75±1.5(P<0.05);術(shù)后第二天流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示Dil標(biāo)記的SO—Rb50瘤細(xì)胞分布于肝、脾、肺和外周血,所占比例分別為12.44%、3.49%、0.26%和1.67%。 2.在接種瘤細(xì)胞后第7天處死的裸小鼠,肉眼見肝臟表面散在灰白色瘤細(xì)胞灶,常規(guī)蘇木素—伊紅染色(HE)染色見肝臟SO—Rb50瘤細(xì)胞成團(tuán)分布,周圍少許中性粒細(xì)
9、胞浸潤,其它臟器未見明顯改變;空白對照裸小鼠未見明顯改變。其他16只接種瘤細(xì)胞的裸小鼠先后出現(xiàn)體重顯著下降,活動(dòng)能力極差,僅1只發(fā)生皮下腫瘤,于72d死亡,HE切片及免疫組化證實(shí)為RB;15只于28d,30d,38d,44d,50d,54d和62d時(shí)相續(xù)死亡,臟器損傷均發(fā)生在肝臟,且改變基本一致。大體觀察見肝臟色暗紅,質(zhì)地較硬,表面粗糙凹凸不平;HE切片見肝內(nèi)大量中性粒細(xì)胞及部分淋巴細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞水腫變性,部分壞死;免疫組織化學(xué)示MP
10、O,CD56,CD68,CD3,CD20和CD79均有不同程度陽性表達(dá),平均每個(gè)視野中性粒細(xì)胞所占比例為41.13%±4.10%,明顯高于T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞(P<0.001);另外,NK細(xì)胞每個(gè)視野所占比例為23.62%±2.82%,明顯高于T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨細(xì)胞(P<0.001);而T細(xì)胞和B細(xì)胞每個(gè)視野分別為12.69%±2.68%、12.61%±2.99%(CD20)和14.70%±1.86%(CD79),兩者之間
11、無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但均高于巨噬細(xì)胞的比例6.71%±1.25%(P<0.05)。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,接種SO—Rb50瘤細(xì)胞后裸小鼠NK細(xì)胞在肝臟內(nèi)的含量顯著高于其他臟器;肝臟和脾臟中NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞以及外周血的NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞隨時(shí)間的增加呈升高趨勢。 結(jié)論: 將SO—Rb50瘤細(xì)胞注入裸小鼠尾靜脈后,瘤細(xì)胞主要分布于肝臟,能誘導(dǎo)裸小鼠肝臟發(fā)生對瘤細(xì)胞排斥反應(yīng),以中性粒細(xì)胞和NK
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