人PGCs來源的EBD細(xì)胞向人心肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:旨在從人的胚胎生殖基中分離出人胚胎生殖脊細(xì)胞(hPGCs),進(jìn)行體外培養(yǎng),并證實(shí)hPGCs 是具有多分化潛能的干細(xì)胞;再從hPGCs中得到類胚體(EB),在EB中得到多分化潛能的干細(xì)胞(人EBD細(xì)胞,hEBDs);將hEBDs植入到體內(nèi),觀察hEBDs在心肌中能否分化為人心肌細(xì)胞,以便為hEBDs在心血管方面的研究與將來在臨床上用于冠心病的治療提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù).方法:(1)從發(fā)育5-7周的人胚胎中分離hPGCs,在體外接種于

2、小鼠STO細(xì)胞中,進(jìn)行體外培養(yǎng);(2)通過形態(tài)學(xué)、AKP活性測(cè)定及細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA-4與TRA-1-60分析對(duì)hPGCs進(jìn)行鑒定;(3)通過懸浮培養(yǎng)得到類胚體(EB),從EB中得到多分化潛能的hEBDs,并運(yùn)用RT-PCR進(jìn)行鑒定;(4)采用顯微注射法,將DAPI標(biāo)記的hEBDs注射到發(fā)育第4天的雞胚心肌中;(5)運(yùn)用人特異性的Alu探針對(duì)人、小鼠、大鼠、雞、兔、狗、羊及豬心肌進(jìn)行DNA原位雜交,以證實(shí)Alu探針的人特異性;(6)

3、運(yùn)用Alu探針DNA原位雜交在術(shù)后存活的雞胚心肌中檢測(cè)人細(xì)胞的存在;(7)運(yùn)用免疫熒光技術(shù)分析人細(xì)胞陽性的雞胚心肌相鄰切片有無人心肌特異性的標(biāo)志物ANP、cTnT及Nkx-25存在;(8)運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)移植hEBDs的雞胚心肌中有無人心肌特異性的標(biāo)記物MLC-2V、MLC-2A、-MHC、CTnT、ANP與NKx-2.5等存在.結(jié)果:(1)從發(fā)育5-7周的人胚胎中分離出hPGCs,在體外能連續(xù)傳代;(2)hPGCs在體外能形成克隆

4、,有AKP活性,存在SSEA-4與TRA-1-60表達(dá);(3)通過懸浮培養(yǎng)hPGCs形成EB,消化EB,得到hEBDs,RT-PCR顯示hEBDs表達(dá)Myf5、GFAP與α-FP;(4)Alu探針DNA原位雜交在人心肌陽性,而小鼠、大鼠、雞、兔、狗、羊及豬心肌均陰性;(5)Alu探針DNA原位雜交顯示,在注射hEBDs的術(shù)后活的雞胚心肌中,有人細(xì)胞存在;(6)免疫熒光顯示存在人細(xì)胞的雞胚心肌相鄰切片中有人心肌特異性的標(biāo)志物ANP、cTn