人PGCs來源的EBD細胞向人心肌細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的:旨在從人的胚胎生殖基中分離出人胚胎生殖脊細胞(hPGCs),進行體外培養(yǎng),并證實hPGCs 是具有多分化潛能的干細胞;再從hPGCs中得到類胚體(EB),在EB中得到多分化潛能的干細胞(人EBD細胞,hEBDs);將hEBDs植入到體內(nèi),觀察hEBDs在心肌中能否分化為人心肌細胞,以便為hEBDs在心血管方面的研究與將來在臨床上用于冠心病的治療提供理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù).方法:(1)從發(fā)育5-7周的人胚胎中分離hPGCs,在體外接種于

2、小鼠STO細胞中,進行體外培養(yǎng);(2)通過形態(tài)學、AKP活性測定及細胞表面標志物SSEA-4與TRA-1-60分析對hPGCs進行鑒定;(3)通過懸浮培養(yǎng)得到類胚體(EB),從EB中得到多分化潛能的hEBDs,并運用RT-PCR進行鑒定;(4)采用顯微注射法,將DAPI標記的hEBDs注射到發(fā)育第4天的雞胚心肌中;(5)運用人特異性的Alu探針對人、小鼠、大鼠、雞、兔、狗、羊及豬心肌進行DNA原位雜交,以證實Alu探針的人特異性;(6)

3、運用Alu探針DNA原位雜交在術(shù)后存活的雞胚心肌中檢測人細胞的存在;(7)運用免疫熒光技術(shù)分析人細胞陽性的雞胚心肌相鄰切片有無人心肌特異性的標志物ANP、cTnT及Nkx-25存在;(8)運用RT-PCR檢測移植hEBDs的雞胚心肌中有無人心肌特異性的標記物MLC-2V、MLC-2A、-MHC、CTnT、ANP與NKx-2.5等存在.結(jié)果:(1)從發(fā)育5-7周的人胚胎中分離出hPGCs,在體外能連續(xù)傳代;(2)hPGCs在體外能形成克隆

4、,有AKP活性,存在SSEA-4與TRA-1-60表達;(3)通過懸浮培養(yǎng)hPGCs形成EB,消化EB,得到hEBDs,RT-PCR顯示hEBDs表達Myf5、GFAP與α-FP;(4)Alu探針DNA原位雜交在人心肌陽性,而小鼠、大鼠、雞、兔、狗、羊及豬心肌均陰性;(5)Alu探針DNA原位雜交顯示,在注射hEBDs的術(shù)后活的雞胚心肌中,有人細胞存在;(6)免疫熒光顯示存在人細胞的雞胚心肌相鄰切片中有人心肌特異性的標志物ANP、cTn