再生心肌細胞的另一新來源——人胎盤組織.pdf

1、目的： 心血管疾病是影響人類健康的主要疾患之一，在臨床上其發(fā)病率與死亡率較高。各種病因?qū)е滦募〖毎蛲?、壞死，造成心肌細胞大量丟失，受損的心肌被瘢痕組織所替代，最終導致心功能衰竭，甚至死亡。其中以心肌梗死、冠心病最為常見。對于缺血性心臟病，傳統(tǒng)的治療方式是通過藥物、介入、溶栓等方法恢復缺血區(qū)的血流量，但并不能阻止心肌不可逆性損傷的進程[1]。心臟移植可以治療嚴重的心功能衰竭，但這一有效的治療措施受供體來源和免疫排斥反應等的限制。

2、盡管研究發(fā)現(xiàn)，心肌中存在具有再生能力的心肌前體細胞(cardiac progenitor cells，CPCs)在心梗后可發(fā)生分裂增殖，但CPCs數(shù)量有限，只能修復毛細血管閉塞后的亞臨床病變，而不能完整地修復組織，不足以阻止心室重構(gòu)、心功能衰竭的發(fā)生。隨著人類對干細胞認識的加深，利用干細胞分化潛能再生心肌細胞，修復受損的心肌組織，恢復心臟功能，已經(jīng)成為目前治療心功能衰竭的一種新的策略，這種可用于移植的干細胞稱為種子細胞。 目前多

3、數(shù)干細胞治療心臟病僅處于細胞培養(yǎng)與動物模型方面，在臨床嘗試中多采用自體骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和外周血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，回避了應用胚胎干細胞的倫理與法律問題，同時自體成體干細胞移植也回避了免疫排斥反應問題。但是，間充質(zhì)干細胞在成人骨髓內(nèi)含量極低，僅占有核細胞數(shù)的0.01-0.1％，并且心血管疾病多好發(fā)于中老年人

4、，因骨髓組織隨年齡增長紅骨髓減少，黃骨髓增多，因此患者骨髓內(nèi)干細胞數(shù)量與質(zhì)量大多降低，患者得不到足夠數(shù)量的干細胞，所以尋找新的干細胞來源及提高其臨床應用效果成為研究熱點。 早在2000年即有學者從凍存的胎盤組織中分離培養(yǎng)出貼壁細胞，近年來，越來越多的實驗證實胎盤中存在大量干細胞，并且這種胎盤來源的干細胞具有多向分化潛能，已證實可以向軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞和肌細胞方向分化[6～8]，但對心肌細胞方向分化的研究報道甚

5、少。本研究從人胎盤中分離干細胞，并誘導其向心肌細胞分化，探討其作為種子細胞治療心肌梗死的可能性，為臨床冠心病的治療提供一條新思路。 方法： 1、胎盤細胞提?。喝∽阍缕蕦m產(chǎn)新生兒的胎盤(來源于沈陽菁華醫(yī)院婦產(chǎn)科健康足月剖宮產(chǎn)新生兒胎盤組織)，剝離子體面蛻膜，剪取蛻膜下組織，PBS(含100U/ml青鏈霉素)沖洗兩次，室溫靜置10min，將組織塊剪碎約1mm3，均勻置于培養(yǎng)皿底部，應用10％DMEM培養(yǎng)基(含10％FBS、0

6、.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青鏈霉素、0.1mmol/L β-巰基乙醇)培養(yǎng)于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱，每3d換液1次，待細胞沿培養(yǎng)皿底部生長面積達80％-90％時，按常規(guī)方法傳代，傳代3次后用于檢測及誘導分化。 2、胎盤細胞表型測定：取第3代細胞，以0.25％胰酶消化3min后，調(diào)整細胞數(shù)為1×106，加入5μl小鼠血清封閉15min后，加入鼠抗人PE標記的單克隆抗體CD13、C

7、D14、CD73、CD90、CD166、HLA-DR，及FITC標記CD29、CD31、CD44、CD45、CD105、HLA-ABC抗體各20min，分別設PE、FITC、空白對照組，冰上避光反應20min，PBS洗2次后，4℃1000r/min離心5min，棄上清后加入200μl冷PBS吹打混勻后，流式細胞儀檢測。 3、心肌細胞分化培養(yǎng)：采用懸滴法培養(yǎng)：取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化并吹打成單個細胞后，制成2.5×104 ce

8、lls/ml細胞懸液，分化培養(yǎng)液為含有0.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青鏈霉素、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、20％胎牛血清的IMDM。細胞懸液以20μl/滴接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿蓋上，培養(yǎng)皿內(nèi)中放入10ml無菌PBS，蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中，3d后，從單個懸滴中吸出形成的懸浮擬胚體(embryonic bodies，Ebs)，轉(zhuǎn)入至預先以0.1％明膠涂抹的24孔

9、細胞培養(yǎng)板中。 4、檢測Ebs分化率：每天于顯微鏡下觀察Ebs的生長情況及出現(xiàn)跳動細胞的時間，以各組Ebs 中出現(xiàn)跳動心肌細胞為分化陽性，并分別與每組總的Ebs的數(shù)量相比，為分化率[10]。計數(shù)Ebs形成的第8d、9d、10d、11d、12d的分化率。 5、免疫細胞化學檢測α-sarcomeric actin表達：將孔板內(nèi)分化細胞重新接種于新的孔板中，同時用未經(jīng)誘導分化的人胎盤干細胞作對照，待24 h細胞貼壁伸展后進行檢

10、測：具體步驟按SABC染色試劑盒說明書操作，棄掉孔板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS(0.02mol/L，pH7.2-7.6)洗3遍，4％多聚甲醛固定30min，0.3％H2O2滅活內(nèi)源性酶，BSA封閉后分別加入1：200稀釋的小鼠抗人α-sarcomeric actin抗體，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，用生物素標記的山羊抗小鼠IgG二抗孵育1h，光鏡下觀察。 6、細胞免疫熒光檢測心肌特異性肌鈣蛋白表達：將孔板內(nèi)分化細胞重新接種于新的孔板中，同時用未經(jīng)

11、誘導分化的人胎盤干細胞作對照，待24h細胞貼壁伸展后進行檢測：PBS洗3遍后，4％多聚甲醛固定30min，封閉液封閉30min，加入1：100稀釋的兔抗人cTnI抗體，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標記山羊抗兔1gG二抗(1：100)室溫避光孵育2h，PBS洗3遍，PI染核后封片，熒光顯微鏡下觀察。 7、RT-PCR檢測心肌特異性基因．Anf、β-MHC mRNA表達：收集第12d Ebs中跳動細胞的總RNA，用RT-PCR方法檢

12、測Anf、β-MHC mRNA，操作步驟嚴格按照說明書進行。 結(jié)果： 1、組織塊培養(yǎng)11d左右，可見后有少量細胞爬出，隨著細胞數(shù)目的增多，貼壁的組織塊逐漸脫落，細胞呈漩渦狀生長或成簇生長，胞體變得細長，形態(tài)類似成纖維細胞，培養(yǎng)3W左右，細胞可達到80％融合，細胞經(jīng)傳代貼壁后，細胞變成梭形并逐漸形成干細胞集落。 2、流式細胞儀檢測顯示：來源于人胎盤組織的第3代細胞表達CD29、CD105，不表達CD13、CD14、

13、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD166、HLA-ABC、HLA-DR。 3、懸滴分化培養(yǎng)法培養(yǎng)3d后將形成的白色的Ebs接種到24孔培養(yǎng)板中，接種后5d(懸滴后8d)，于倒置顯微鏡下觀察到Ebs周圍可見到自發(fā)性節(jié)律收縮的心肌細胞團，不同Ebs中的心肌合胞體顯示出的收縮性和形態(tài)有所不同。 4、α-橫紋肌肌動蛋白的細胞免疫化學檢測發(fā)現(xiàn)細胞胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒的陽性結(jié)果，陽性率為47.2％，與對照組(5.6

14、％)比較有顯著性差異(P<0.05)，而對照組胞漿染色呈陰性。 5、心肌特異性肌鈣蛋白I的細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)誘導12d的細胞染色呈陽性，陽性率為41.8％，與對照組(1.2％)比較有顯著性差異(P<0.05)，胞漿發(fā)出強烈的綠色熒光，可見心肌細胞特征性橫紋結(jié)構(gòu)，而對照組胞漿染色呈陰性。 6、在第12d跳動的心肌細胞群中，可見心肌細胞特征性基因Anf、β-MHC表達。 結(jié)論： 1、胎盤中存在著豐富的干細胞

15、，不僅來源廣泛，且對其研究不會涉及倫理道德和法律問題，為人類提供了新的干細胞種子來源。 2、利用“懸滴-貼壁”培養(yǎng)法可誘導胎盤來源的干細胞向心肌細胞分化，被誘導分化成有節(jié)律性跳動的心肌細胞群，且均不同程度表達各種心肌細胞特征性基因和心肌蛋白。 總之，采用“懸滴-貼壁”培養(yǎng)法將胎盤來源的干細胞誘導分化成節(jié)律性跳動的心肌細胞群，并且胎盤干細胞的提取對胎兒與母體均不產(chǎn)生損傷作用，對其研究不會涉及倫理法律問題，且來源廣泛，可以作