TPX2在人甲狀腺髓樣癌中的表達及其對甲狀腺髓樣癌TT細胞增殖凋亡影響的研究.pdf

1、目的:TPX2(targetingproteinforXenopuskinesin-likeprotein2)是近年來研究較熱的一種微管相關(guān)蛋白，在有絲分裂紡錘體形成過程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)其過表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本實驗旨在探討TPX2在甲狀腺髓樣癌組織中的表達情況及其與甲狀腺髓樣癌患者臨床病理因素的相關(guān)性，并運用RNA干擾技術(shù)，通過特異性的抑制TPX2在甲狀腺髓樣癌TT細胞中的表達，研究其對甲狀腺髓樣癌細胞增殖、凋

2、亡以及周期分布的影響，并探討其可能的作用機制，為以TPX2為靶點的甲狀腺髓樣癌治療提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1采用免疫組織化學(xué)染色法檢測32例甲狀腺髓樣癌組織和8例正常甲狀腺組織中TPX2的表達，并分析其與甲狀腺髓樣癌臨床病理因素的聯(lián)系。
　　 2設(shè)計并合成4對靶向人TPX2基因的小干擾RNA(TPX2-siRNA-1、TPX2-siRNA-2、TPX2-siRNA-3、TPX2-siRNA-4)致TP

3、X2基因沉默。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。Real-timePCR檢測TPX2mRNA表達水平并篩選出最有效的siRNA。
　　 3采用MTT法檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡及周期分布。采用Westernblot法檢測TPX2、Aurora-A、CyclinB1和野生型P53蛋白（wt-p53）表達水平。
　　 4統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS16.0軟件分析，計數(shù)資料比較采用x2檢驗;計量資料采用均數(shù)±標

4、準差表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1免疫組化結(jié)果:TPX2蛋白在甲狀腺髓樣癌組織中的陽性表達率(62.5％，20/32)顯著高于正常甲狀腺組織(0％，0/8)(P＜0.05)。并且TPX2在甲狀腺髓樣癌組織中陽性表達率的高低與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān)(P＜0.05)而與性別、年齡及是否存在甲狀腺炎癥無關(guān)(P＞0.05)。
　　 2轉(zhuǎn)

5、染效率的優(yōu)化及最佳siRNA篩選:Lipofectamine2000與熒光標記siRNA分別以不同比例搭配時，轉(zhuǎn)染效率不同，以1∶2比例搭配時轉(zhuǎn)染效率最高，為（96.23±2.53）％（P＜0.05）。4對TPX2-siRNA轉(zhuǎn)染TT細胞24h后均發(fā)揮沉默效應(yīng)，尤以TPX2-siRNA2沉默效果最佳，TPX2-siRNA2組TPX2mRNA表達量較空白對照組下降（87.7±6.16）％(P＜0.05)，而陰性對照組和空白對照組之間差異無

6、統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3MTT檢測結(jié)果:TPX2-siRNA2作用于TT細胞48h后其增殖特性開始受到抑制，至72h抑制作用最為明顯，生長抑制率26.7％。
　　 4FCM檢測細胞凋亡、周期分布結(jié)果:轉(zhuǎn)染后72小時，轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率較空白對照組顯著升高[（14.96±2.69）％vs（2.24±0.62）％](P＜0.05)，而空白對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 細胞周

7、期分布:轉(zhuǎn)染后72小時，與空白對照及陰性對照組相比，TPX2-siRNA2轉(zhuǎn)染組細胞G2/M期細胞比例上升(P＜0.05)，S期細胞比例下降(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染后發(fā)生了G2/M及G1/S雙期阻滯。
　　 5Westernblot結(jié)果:轉(zhuǎn)染后72小時westernblot結(jié)果顯示，實驗組TPX2蛋白表達量較空白對照組、陰性對照組顯著降低（0.124±0.017vs0.407±0.022、0.393±0.020）(P＜0.05)，

8、而陰性對照組和空白對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。TPX2-siRNA2轉(zhuǎn)染TT細胞后，與空白對照組相比，Aurora-A和CyclinB1的表達水平明顯下調(diào);wt-p53蛋白表達上調(diào)(P＜0.05);空白對照組和陰性對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、甲狀腺髓樣癌組織中TPX2蛋白表達的陽性率高于正常甲狀腺組織，并且在甲狀腺髓樣癌組織中TPX2蛋白的陽性率高低與患者臨床分期