柔腦膜細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、長期以來腦膜被視為是僅具有保護(hù)作用的非神經(jīng)組織，在結(jié)構(gòu)和功能上與腦實(shí)質(zhì)有本質(zhì)的不同，但在上世紀(jì)90年代Mercier等應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法清晰地勾勒出柔腦膜細(xì)胞與腦實(shí)質(zhì)內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元之間有網(wǎng)狀的復(fù)雜聯(lián)系，從而提出柔腦膜細(xì)胞參與腦內(nèi)某些生理或病理過程的可能性，引發(fā)了對柔腦膜功能的深入思考。新近的一些研究發(fā)現(xiàn)：腦膜中的柔腦膜細(xì)胞(leptomeningealcells)表達(dá)和分泌多種細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)，參與中樞的免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)發(fā)育神經(jīng)元的

2、遷移定位，并與小腦功能的完善及腦內(nèi)酶屏障的構(gòu)成密切相關(guān)。
　　但是，柔腦膜細(xì)胞與神經(jīng)元生長、分化的關(guān)系還存在爭議。有研究認(rèn)為柔腦膜細(xì)胞分泌的抑制神經(jīng)突起生長的因子是神經(jīng)元損傷后修復(fù)的障礙；也有研究指出柔腦膜細(xì)胞能分泌神經(jīng)生長因子等多種促神經(jīng)突起再生的因子，并作為滋養(yǎng)層支持神經(jīng)干細(xì)胞的體外生長。新近的研究還注意到成年大鼠柔腦膜層有神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)ex/ssea-1的表達(dá)。這些結(jié)果提示柔腦膜細(xì)胞與神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)、尤其與神經(jīng)干細(xì)胞之

3、間可能存在著某種特殊聯(lián)系，為進(jìn)一步探索柔腦膜細(xì)胞的功能提供了新思路。
　　針對以上問題，我們以柔腦膜細(xì)胞為研究對象，設(shè)計(jì)了五組實(shí)驗(yàn)，從在體和體外細(xì)胞培養(yǎng)的角度，結(jié)合應(yīng)用柔腦膜鋪片、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光標(biāo)記、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、Westernblot等研究方法，對柔腦膜細(xì)胞可能具有的神經(jīng)干細(xì)胞特性做了初步探討。第一組實(shí)驗(yàn)觀察了正常成年以及不同生長發(fā)育期大鼠腦內(nèi)柔腦膜細(xì)胞是否表達(dá)經(jīng)典的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志巢蛋白（nestin）

4、；第二組實(shí)驗(yàn)在成功建立單純?nèi)崮X膜細(xì)胞培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，檢測了柔腦膜細(xì)胞能否表現(xiàn)出自我更新以及多向分化等神經(jīng)干細(xì)胞的生物特性；第三組至第五組實(shí)驗(yàn)分別觀察了不同調(diào)控因素（白細(xì)胞介素-6、抗抑郁藥物以及機(jī)械損傷）對于柔腦膜來源神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響。
　　主要結(jié)果有：
　　實(shí)驗(yàn)一
　　一、正常成年SD大鼠及Balb/c小鼠的柔腦膜層中均可檢測到神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物nestin的表達(dá)，但表達(dá)水平低，主要局限于腦腹側(cè)及大腦鐮

5、兩側(cè)的腦膜組織。兩種動物柔腦膜組織中陽性細(xì)胞的形態(tài)與分布存在差異。
　　二、不同生長發(fā)育期SD大鼠的柔腦膜細(xì)胞中nestin蛋白表達(dá)水平隨生長發(fā)育呈進(jìn)行性降低。柔腦膜鋪片中除nestin/Thy1.1雙標(biāo)陽性的柔腦膜細(xì)胞外，也有GFAP/nestin陽性細(xì)胞存在。
　　以上結(jié)果說明，不同生長發(fā)育期SD大鼠的柔腦膜細(xì)胞均可表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志nestin，即具有神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖潛能，但此潛能隨生長發(fā)育而進(jìn)行性減弱。
　　

6、實(shí)驗(yàn)二
　　一、比較腦膜組織在不同培養(yǎng)條件下柔腦膜細(xì)胞的純度，發(fā)現(xiàn)以DMEM/5％FCS/5％HS培養(yǎng)時，培養(yǎng)體系中除柔腦膜細(xì)胞外，還存在約30％的星形膠質(zhì)細(xì)胞和少量神經(jīng)元；以DMEM/1％FCS/9％HS培養(yǎng)時，柔腦膜細(xì)胞純度達(dá)90％以上，幾乎沒有神經(jīng)元沾染。后者繼續(xù)傳代可使其純度達(dá)97％以上，僅有極少數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞存活。結(jié)果提示改變培養(yǎng)條件及多次傳代是建立單純?nèi)崮X膜細(xì)胞體系的有效方法。
　　二、檢測單純培養(yǎng)的柔腦膜細(xì)胞是

7、否具有神經(jīng)干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性。發(fā)現(xiàn)：給予含生長因子EGF/bFGF的無血清條件性培養(yǎng)基后，柔腦膜細(xì)胞可自我增殖形成神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)，其成球性呈bFGF濃度依賴性；再以胎牛血清誘導(dǎo)分化，可見除Thy1.1陽性的柔腦膜細(xì)胞外，還可分化為β-tubulinIII、GFAP、RIP陽性的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞；并且柔腦膜細(xì)胞經(jīng)多次傳代仍可形成克隆球及多向分化，但能力逐漸減弱。
　　以上結(jié)果說明，間充質(zhì)來源的柔腦膜細(xì)胞經(jīng)體外分離培養(yǎng)后能夠表現(xiàn)出自

8、我更新以及多向分化等神經(jīng)干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，并可分化形成神經(jīng)元。
　　實(shí)驗(yàn)三
　　一、白細(xì)胞介素-6（IL-6）可以誘導(dǎo)柔腦膜來源的神經(jīng)球向神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞多向分化，并顯著提高分化神經(jīng)元的比例。以多種神經(jīng)元標(biāo)記物鑒定分化神經(jīng)元性質(zhì)，提示其為5-HT陽性的未成熟神經(jīng)元。
　　二、免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Westernblotting結(jié)果均提示，IL-6孵育可顯著上調(diào)其自身受體（IL-6Rα及gp130）在柔腦膜來源神經(jīng)球內(nèi)

9、的表達(dá)，為柔腦膜細(xì)胞感受IL-6信號并發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。
　　三、上述體系中，IL-6也引起磷酸化ERK1/2及STAT3分子在柔腦膜來源神經(jīng)球中的表達(dá)。而分別給予其特異性抑制劑PD98059及AG490后，發(fā)現(xiàn)ERK1/2通路磷酸化的抑制可影響神經(jīng)球向神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的分化，而STAT3通路磷酸化的抑制則以星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的受抑為主。同時，STAT3分子磷酸化提示gp130處于活化狀態(tài)。
　　以上結(jié)果說明，細(xì)胞

10、因子IL-6可促進(jìn)柔腦膜來源神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，而分化神經(jīng)元呈5-HT反應(yīng)陽性。IL-6刺激引起了其自身受體及磷酸化ERK1/2及STAT3信號分子在該細(xì)胞體系中的表達(dá)，提示上述細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制可能參與了柔腦膜細(xì)胞向神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的分化。
　　實(shí)驗(yàn)四
　　一、以抗抑郁藥物西酞普蘭孵育柔腦膜來源的神經(jīng)球，發(fā)現(xiàn)：西酞普蘭能夠維持神經(jīng)球的克隆化生長、促進(jìn)細(xì)胞增殖，并引起細(xì)胞內(nèi)ERK1/2、STAT3信號分子磷酸化；以信號通路抑

11、制劑預(yù)處理的結(jié)果顯示，西酞普蘭誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的效應(yīng)表現(xiàn)為ERK1/2通路依賴性。
　　二、觀察西酞普蘭孵育對柔腦膜來源的已貼壁分化的神經(jīng)干細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)：西酞普蘭可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞繼續(xù)分化，并顯著上調(diào)分化神經(jīng)元的比例；同時也引起了分化細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK1/2、STAT3分子的表達(dá)。以信號通路抑制劑預(yù)處理的結(jié)果顯示，上述體系中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化分別表現(xiàn)為ERK1/2或STAT3通路依賴性。
　　以上結(jié)果說明，西酞普蘭可以誘導(dǎo)

12、柔腦膜來源神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，也可促進(jìn)其向神經(jīng)元分化。但是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的機(jī)制不同，分別表現(xiàn)為ERK1/2通路或ERK1/2及STAT3通路依賴性。
　　實(shí)驗(yàn)五
　　一、建立柔腦膜細(xì)胞的體外機(jī)械損傷模型，檢測機(jī)械損傷對細(xì)胞增殖及逆分化的影響。結(jié)果顯示：劃傷刺激促進(jìn)了柔腦膜細(xì)胞增殖，但不能誘導(dǎo)其表達(dá)nestin蛋白；而含生長因子的無血清條件性培養(yǎng)基可誘導(dǎo)損傷細(xì)胞形成神經(jīng)球，后者在血清存在時向神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞分化。
　　二

13、、觀察損傷的柔腦膜細(xì)胞對正常星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及逆分化的影響，發(fā)現(xiàn)：損傷的柔腦膜細(xì)胞可以誘導(dǎo)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖并表達(dá)nestin，后者也可形成神經(jīng)球并向神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞分化。
　　以上結(jié)果說明，機(jī)械損傷雖然不能直接誘導(dǎo)柔腦膜細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，但可以刺激細(xì)胞分泌某些活性物質(zhì)，誘導(dǎo)與之共培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖并逆分化為神經(jīng)前體細(xì)胞。并且，細(xì)胞微環(huán)境對于細(xì)胞能否表現(xiàn)出神經(jīng)干細(xì)胞特性具有重要意義。
　　結(jié)論：
　　本研究

14、從不同的角度證實(shí)：起源于間充質(zhì)組織的柔腦膜細(xì)胞能夠表現(xiàn)出神經(jīng)干細(xì)胞的基本特性，自我增殖并在適當(dāng)條件下分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞；不同性質(zhì)的刺激（細(xì)胞因子、抗抑郁藥物以及機(jī)械損傷等）可調(diào)控其增殖分化；神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，柔腦膜細(xì)胞可能分泌活性物質(zhì)而參與誘導(dǎo)腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖活化。根據(jù)以上結(jié)果，我們提出了腦膜細(xì)胞可能是腦內(nèi)潛在的神經(jīng)干細(xì)胞的觀點(diǎn)。這些初步發(fā)現(xiàn)將為我們更加全面、深入地認(rèn)識柔腦膜細(xì)胞的功能奠定了基礎(chǔ)，為神經(jīng)損傷