NDV La Sota與V4株對(duì)雞T細(xì)胞亞群影響及其F蛋白抗原優(yōu)勢(shì)表位的比較研究.pdf

1、該研究應(yīng)用親水性、可及性和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等5種參數(shù)對(duì)新城疫LaSota和V4株F蛋白的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了綜合預(yù)測(cè);采用Margalit的AMPHI法則等3種預(yù)測(cè)方案對(duì)La Sota、V4株的F蛋白T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了綜合預(yù)測(cè).預(yù)測(cè)到二者的F蛋白B細(xì)胞抗原表位分別有19個(gè),T細(xì)胞抗原表位有24個(gè).比較發(fā)現(xiàn),兩個(gè)毒株有9個(gè)預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位氨基酸序列存在差異,有11個(gè)預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位氨基酸序列存在差異.在此預(yù)測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上,我們進(jìn)行了表位的鑒定

2、、篩選和比較研究.首先利用RT-PCR方法擴(kuò)增并克隆了中國(guó)目前使用的NDV La Sota疫苗株F基因全序列,其包含了F基因完整的開(kāi)放閱讀框架(全長(zhǎng)1662bp),與國(guó)外發(fā)表的La Sota疫苗株F基因核苷酸序列同源性高達(dá)99.8﹪.將兩毒株F基因預(yù)測(cè)存在差異的表位,根據(jù)序列位置鄰近合并分成6段表位區(qū),以構(gòu)建的La Sota疫苗株F基因和該課題保存的V4株F基因?yàn)槟０?分別對(duì)每個(gè)毒株的6段表位區(qū)進(jìn)行了亞克隆,構(gòu)建了每個(gè)毒株的6個(gè)預(yù)測(cè)區(qū)的

3、表達(dá)載體,對(duì)每個(gè)毒株的5個(gè)預(yù)測(cè)區(qū)進(jìn)行了表達(dá).5段多肽的大小分別是,P1:8.0KD、P2:10.8KD、P4:11.6KD、P5:13.5KD、P6:10.5KD.應(yīng)用建立的Tricine緩沖體系5﹪-20﹪線性梯度聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行了分析,證明所表達(dá)的肽段主要以包涵體形式存在,并成功地用Ni-NTA膠對(duì)其進(jìn)行了純化.分別應(yīng)用自制的La Sota與V4特異性抗血清,利用Western Blot對(duì)表達(dá)的各肽段(P1-P6

4、)進(jìn)行了抗原性鑒定.結(jié)果P1、P4、P5、P6段呈陽(yáng)性反應(yīng),說(shuō)明其中含有線性B細(xì)胞表位.這4段分別位于F蛋白的1-48aa、201-274aa、377-458aa、469-530aa,以前發(fā)現(xiàn)的中和性表位均不在這4段區(qū)域內(nèi).而P2段在Western Blot中無(wú)抗體反應(yīng)性,表明它不含線性表位.比較研究發(fā)現(xiàn)NDV La Sota與V4株的P1、P4區(qū)的B細(xì)胞表位活性存在著重要的差異,這兩段分別存在于F1、F2蛋白上距離融合肽均較近的超螺旋

5、區(qū),這種差異可能造成兩個(gè)毒株的免疫原性差異.該試驗(yàn)結(jié)果首次對(duì)NDV La Sota P5與V4株的細(xì)胞免疫和抗原表位差異進(jìn)行了全面系統(tǒng)的比較研究,證實(shí)了V4疫苗株激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能優(yōu)于La Sota,闡明了兩疫苗免疫特點(diǎn)不同的理論基礎(chǔ),并初步證實(shí)產(chǎn)生免疫原性差異的分子基礎(chǔ)在于抗原表位的不同,為進(jìn)一步精細(xì)的研究?jī)蓚€(gè)毒株的抗原表位、找到二者優(yōu)勢(shì)抗原表位的差異,以探索二者免疫機(jī)制的不同,研制集合兩毒株不同優(yōu)勢(shì)表位特點(diǎn)的表位DNA疫苗奠定了