牛結(jié)核外周血IFN--γ體外釋放試驗刺激原的篩選與鑒定.pdf

1、萬婷：牛結(jié)核外周血IFNY體外釋放試驗刺激原的篩選與鑒定三牛結(jié)核外周血IFN一7體外釋放試驗刺激原的篩選與鑒定研究生：萬婷導(dǎo)師：陳祥副教授焦新安教授摘要牛結(jié)核病(Bovinetuberculosis，bTB)是由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis，必bovis)等感染引起的一種人獸共忠慢性消耗性傳染病，該病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列入需通報的動物疫病之一。Mboris擁有廣泛的宿主，而牛是最敏感的宿主之一，它不僅能在動

2、物之間傳播，還能從動物傳染給人，牛結(jié)核病的流行直接影響了畜牧業(yè)的生產(chǎn)力及人類的生命健康。因此，簡單、快速、準確的牛結(jié)核診斷方法對于該病的防控具有重要的意義。IFN7試驗是一種體外T細胞免疫檢測試驗。傳統(tǒng)用于IFNY試驗的刺激原是結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)，由于PPD成分復(fù)雜，包含很多廣泛分布的分枝桿菌抗原，使診斷易存在假陽性的結(jié)果。由于PPD在生產(chǎn)過程中存在定性定量的困難，難以保證批次間的穩(wěn)定性，所以使用PPD作為刺激原的IFN吖試

3、驗其特異性及穩(wěn)定性有待進一步提高。結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌等致病性分枝桿菌特異性抗原蛋白，如ESAT6、CFPl0和TB77(也稱Rv2654c)等成分明確、制各簡單、且易于質(zhì)控，將其用于IFN：y檢測時可以提高檢測的特異性及重復(fù)實驗的穩(wěn)定性。本研究通過大腸桿菌系統(tǒng)成功表達了rHisCFPl0ESAT6TB77(簡稱rHis—CE—TB77)融合蛋白，并對包括該融合蛋白在內(nèi)的28種結(jié)核分枝桿菌重組抗原進行牛結(jié)核外周血IFN7體外釋放試驗

4、，系統(tǒng)的評價與篩選出候選刺激原，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。1、結(jié)核分枝桿菌CFPl0ESAT6TB77的融合表達、純化和鑒定PCR擴增，幼一esat61inker和linker—Rv2654c目的片段，構(gòu)建pET32a()Z幼一esat6一linker—Rv2654c原核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，免疫親和層析純化，SDS—PAGE分析顯示在約45kDa處出現(xiàn)目的條帶，說明融合蛋白獲得可溶性表達。Western

5、blot顯示rHisCE—TB77融合蛋白能分別與ESAT6單抗、His單抗、CFPl0單抗和TB77多抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有良好的免疫反應(yīng)性。將純化后的rHis。CETB77蛋白與DDA佐劑充分乳化后皮下免疫6周齡C57BL／6雌萬婷：牛結(jié)核外周血IFN—v體外釋放試驗刺激原的篩選與鑒定3一ScreeningandidentificationofrecombinantproteinsasstimulantsinMycobac

6、teriumbov&gammainterferonreleaseassayforcattleMScandidate：TingWanAdvisors：AssoProfXiangChenProfXin’anJiaoAbstractBovinetuberculosis(bTB)whichcausedbyMycobacterium6DV括(Mbov壇)isconsideredasignificanteconomicalissueandanimp

7、ortanthealthproblem，andisdeemedtobetheoneoftheanimalepidemicneededtoinformbytheOfficeInternationaldesEpizooties(OIE)Becausecattlearetheprincipalmaintenancehostsamongdomesticanimals，thediseasepresentsamajortradebarrierfor

8、animalrelatedproductsandlivestockproduction，causingsignificantlossesinruraleconomiesworldwideAsaresult，simple，rapidandaccuratediagnosticassayforthepreventionandcontrolofthisdiseasehasagreatsignificanceTheinterferongamma(

9、IFN一丫)assayisbasedoncellmediatedimmunity(CMI)response，whichdependsontheresponseagainstpurifiedproteinderivative(PPD)tuberculinBovinePPDisapoordefinedmixofproteins，whichcallexplainthelowspecificityofthetestandthevariation

10、sinspecificityandsensitivityfrombatchto—batchToovercometheseissues，antigensspecifictopathogenicmycobacteriaincludingtheMtbandMbo、isarebeingstudiedTakingESAT6，CFP10andTB77(alsoknownasRv2654c)forexample，becauseoftheirclear

11、backgroud，easypreparationandqualitycontrol，theyCanimprovethespecificityofthedetectionInthisstudy，thefusionproteinCFPIOESAT6一TB77(hereinaftercalledCE—TB77)wasexpressedsuccessfullybyEcoliexpressionsystemand28fusionproteins