山慈菇（杜鵑蘭）快速繁殖技術(shù)優(yōu)化及鐵皮石斛葉cDNA PCR文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、山慈菇是常用的名貴中藥材，具有清熱解毒、化痰散結(jié)等功效，臨床上常用作抗腫瘤藥物?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(國(guó)家藥典委員會(huì)，1995，2000，2005)記載:山慈菇為蘭科(Orchidaceae)植物杜鵑蘭(Cremastra appendiculata(D.Don)Makino)、獨(dú)蒜蘭(Pleione bulbocod ioides(Franch.) Rolfe）或云南獨(dú)蒜蘭(Pleioneyunnanensis Rolfe)的干燥假

2、鱗莖，主要分布于四川、云南、貴州等長(zhǎng)江以南各省區(qū)。由于具有較大的藥用價(jià)值，因此對(duì)于山慈菇的需求量較大，同時(shí)自身繁殖率低，使得野生山慈菇（杜鵑蘭）的生存狀態(tài)惡化，數(shù)量急劇減少。因此，通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)其體外的快速繁殖具有重大的藥用、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境意義。課題以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的杜鵑蘭為外植體，通過(guò)最佳基本培養(yǎng)基、最佳植物激素及濃度、最佳有機(jī)添加物及濃度的確定，再進(jìn)行四因素四水平的正交試驗(yàn)，從而獲得杜鵑蘭體外快速繁殖的最佳培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

3、最佳基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，最佳激素濃度為1.0mg/L NAA，最佳有機(jī)添加物濃度為100g/L土豆汁(PE)。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，1/2MS+50g/L BE+50g/L PE+0.75mg/L6-BA+0.75mg/LNAA，30.0g/L蔗糖，3.0g/L活性炭，5.5g/L瓊脂，pH值5.8～6.2，為杜鵑蘭體外快速繁殖的最佳培養(yǎng)條件。另選取各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期具有特征的材料，采用石蠟切片技術(shù)對(duì)杜鵑蘭形態(tài)發(fā)生過(guò)程進(jìn)行觀察，結(jié)合杜鵑

4、蘭外部形態(tài)發(fā)育過(guò)程，對(duì)其發(fā)育進(jìn)行初步研究。
　　另以RACE技術(shù)為基礎(chǔ)，鐵皮石斛（Dend rob ium candidum）葉總RNA為起始材料，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和末端轉(zhuǎn)移構(gòu)建出兩端含有特定序列的cDNA，然后以連接有引入序列的引物進(jìn)行PCR，在實(shí)驗(yàn)條件下擴(kuò)增生物體中微量mRNA的cDNA，構(gòu)建cDNA PCR文庫(kù)。該方法構(gòu)建的cDNA PCR文庫(kù)能使cDNA放大100倍以上。通過(guò)比較，cDNAPCR文庫(kù)的PCR效果明顯高于逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物