早實(shí)枳TFL1-CEN同源基因的表達(dá)分析及功能特征.pdf

1、童期的發(fā)育機(jī)理一直是木本植物育種進(jìn)程中備受矚目的問(wèn)題，尤其是對(duì)一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的林木和收獲果實(shí)為目的的果樹(shù)來(lái)說(shuō)。如何縮短童期進(jìn)而提高育種效率,一直是果樹(shù)分子生物學(xué)研究的重要課題。20世紀(jì)70年代末在我國(guó)宜昌境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一株早花的枳殼突變體，該突變體在播種后第一年就有20％的開(kāi)花，第三年全部開(kāi)花，并且可以在一年內(nèi)多次開(kāi)花。與普通枳相比，其童期大大縮短，正是因?yàn)檫@個(gè)特性而被命名為早實(shí)枳(precocioustrifoliateorange

2、,Poncirustrifoliata(L.)Raf.)。早實(shí)枳短童期階段的特性為研究木本植物童期發(fā)育的分子機(jī)理提供了一個(gè)寶貴的材料。
　　 早期的果樹(shù)成花研究主要集中于生理生化方面，包括環(huán)境因子及栽培技術(shù)措施對(duì)實(shí)生苗成花的影響等，而對(duì)果樹(shù)開(kāi)花的分子機(jī)制及其遺傳調(diào)控的研究相對(duì)較少。本課題主要對(duì)從早實(shí)枳中分離的兩個(gè)控制木本植物童期發(fā)育的關(guān)鍵基因(PtTFL1和PtTFL2)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，通過(guò)實(shí)時(shí)定量研究了這兩個(gè)基因在不同環(huán)

3、境因子影響下的響應(yīng)，并通過(guò)在不同基因型的煙草中表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證。研究主要結(jié)果如下：
　　 1.通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在PtTFL1和PtTFL2的全長(zhǎng)序列內(nèi)都存在4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，均編碼一個(gè)173個(gè)氨基酸讀碼框，預(yù)測(cè)的分子量分別為19.5kDa和19.2kDa，等電點(diǎn)分別為9.24和8.79；并在讀碼框內(nèi)均存在1個(gè)PEBPmotif,而且在兩個(gè)序列內(nèi)，PEBP家族基因的兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)His88(85位組氨酸)和Asp144

4、(140位天冬氨酸)都保守。在核苷酸水平上與甜橙CiTFL分別有98％和71％的一致性：此外，PtTFL1和PtTFL2在核苷酸序列上有77％一致性。
　　 2.對(duì)早實(shí)枳通過(guò)光周期、GA3和不同的溫度處理后，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)了PtTFL1和PtTFL2對(duì)這些環(huán)境因子的響應(yīng)。結(jié)果顯示：在短日照和低溫處理后，兩個(gè)基因均呈現(xiàn)下降的表達(dá)趨勢(shì)。而當(dāng)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)日照、GA3和冷處理后，雖然在開(kāi)花過(guò)程中兩個(gè)基因的功能相似，但是其表達(dá)水平卻呈現(xiàn)了相

5、反的表達(dá)模式，可能是這兩個(gè)基因在開(kāi)花過(guò)程中的功能是通過(guò)不同的調(diào)控模式來(lái)實(shí)現(xiàn)的，從而導(dǎo)致了對(duì)一些因素的響應(yīng)不同。
　　 3.煙草葉片和早實(shí)枳莖段對(duì)HygB的敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示：它們都對(duì)HygB敏感，結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果及考慮到抗生素對(duì)外植體的傷害，初步確定NicotianatabacumLinn.葉片在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中對(duì)HygB的篩選壓為5mg/L,Nicotiananudicaulis葉片篩選壓為2.5mg/L，早實(shí)枳莖段篩選壓為2.5

6、mg/L，為下一步利用HygB進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)化植株提供依據(jù)。
　　 4.為了研究PtTFL1和PtTFL2的功能特征，分別在兩種煙草N.nudicaulis和N.tabacumLinn.中超表達(dá)，通過(guò)PCR及RT-PCR鑒定兩種轉(zhuǎn)化煙草發(fā)現(xiàn)，在N.nudicaulis的轉(zhuǎn)化植株中：PtTFL1有27株呈現(xiàn)了陽(yáng)性，陽(yáng)性率為90％,PtTFL2有38株呈現(xiàn)了陽(yáng)性，陽(yáng)性率為47.5％；PtTFL1和PtTFL2的T0代植株與對(duì)照相比，除了

7、2株較野生型早開(kāi)花，其余均出現(xiàn)了不同程度的晚花，轉(zhuǎn)基因植株平均比野生型晚20d左右開(kāi)花，轉(zhuǎn)PtTFL1植株比轉(zhuǎn)PtTFL2植株早開(kāi)花約2d的時(shí)間。在N.tabacumLinn.的轉(zhuǎn)化株中：PtTFL1有5株呈現(xiàn)了陽(yáng)性，陽(yáng)性率為83.3％,PtTFL2有11株呈現(xiàn)了陽(yáng)性，陽(yáng)性率為61.1％；PtTFL1和PtTFL2轉(zhuǎn)化植株均比野生型晚開(kāi)花，而最初的差異主要表現(xiàn)在腋芽和節(jié)間長(zhǎng)度方面，轉(zhuǎn)化PtTFL1的植株莖基部均有大量腋芽發(fā)生，并且節(jié)間短