家蠶限性黃繭Ys品種SSHcDNA文庫構(gòu)建及類胰凝乳蛋白酶基因的研究.pdf

1、家蠶是鱗翅目模式生物,其天然有色繭是具有重大應(yīng)用前景的遺傳資源。目前,國內(nèi)外家蠶有色繭分子遺傳研究和應(yīng)用還剛剛起步,由于家蠶繭色受多基因調(diào)控,遺傳機(jī)制了解不詳,挖掘和研究繭色調(diào)控基因是被公認(rèn)的有效突破口之一。
　　 家蠶Ys品種是本研究室選育和保存的限性黃繭品種,其雌為黃繭,雄為白繭,為研究黃、白繭之間差異表達(dá)基因提供了非常好的材料。本文以家蠶限性黃繭Ys品種為材料,用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了Ys品種雌特異表達(dá)基因的c

2、DNA文庫,結(jié)合RACE-PCR技術(shù)和生物信息學(xué)方法對雌雄差異表達(dá)的類胰凝乳蛋白酶基因(Chymotrypsin-like proteinase gene,Ctlp gene)進(jìn)行了克隆鑒定、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子進(jìn)化分析,用RT-PCR和Real-Time PCR等技術(shù)調(diào)查了5齡3天不同組織中Ctlp基因的表達(dá)譜,并進(jìn)行了原核表達(dá)初步研究。獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1家蠶限性黃繭Ys品種雌特異表達(dá)基因的cDNA文庫
　　

3、在SSH方法構(gòu)建的家蠶限性黃繭Ys品種雌特異表達(dá)基因的cDNA文庫中,隨機(jī)挑選克隆測序得到94個(gè)EST,其中9個(gè)為有確定注釋的EST序列,5個(gè)EST序列是未知的。有注釋的EST序列分別為NAPDH氧化還原酶、真核起始因子5A,熱休克同源蛋白、絲氨酸蛋白酶前體、包含絨毛膜基因序列基因、β-微管蛋白和3個(gè)核糖體RNA和蛋白基因。WEGO分析結(jié)果表明這些注釋基因主要分為細(xì)胞組成、分子功能和生物進(jìn)程三部分,參與了能量代謝、細(xì)胞組成、結(jié)合活性和催

4、化活性等各種復(fù)雜的生命活動(dòng)。
　　 2克隆鑒定了家蠶類胰凝乳蛋白酶基因Ctlp
　　 選擇在家蠶雌性消化管特異高水平表達(dá)的EST進(jìn)行了基因挖掘與克隆,克隆基因的全長cDNA序列976 bp,最長ORF為840 bp,編碼279個(gè)氨基酸。蛋白序列分析表明,該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于分泌蛋白,蛋白分子量為29780.10(或29781.00),等電點(diǎn)8.75(或9.07),在其氨基酸殘基1-20和50-100兩個(gè)區(qū)域有由內(nèi)到外的

5、跨膜螺旋,該蛋白的α螺旋約占17.56％,延伸鏈約占27.60％,β轉(zhuǎn)角約占8.60％,隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)約占46.24％。含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、11個(gè)N-十四?；稽c(diǎn)、1個(gè)胰蛋白酶家族中絲氨酸蛋白酶的組氨酸活性位點(diǎn)、1個(gè)胰蛋白酶家族絲氨酸蛋白酶的絲氨酸活性位點(diǎn)、1個(gè)氨甲酰磷酸鹽合成酶亞基標(biāo)簽2。蛋白功能域(保守區(qū))分析結(jié)果表明,該基因編碼蛋白質(zhì)的38-274位氨基酸屬于胰蛋白酶類似的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域,分子進(jìn)化分

6、析表明,該蛋白屬于昆蟲的胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin),與煙芽夜蛾(Heliothis virescens,H.virescens)、甜菜夜蛾(Spodopera exigua,S.exigua)和棉鈴蟲(Heliothis armigera,H.armigera)等鱗翅目昆蟲的親緣關(guān)系最近,與脊椎動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),符合傳統(tǒng)意義上的進(jìn)化關(guān)系。因此命名該基因?yàn)轭愐饶榈鞍酌富?Chymotrypsin-likeprotein

7、ase gene,Ctlp gene)。
　　 3家蠶Ctlp基因的表達(dá)譜結(jié)果
　　 家蠶EST表達(dá)譜分析結(jié)果表明,Ctlp基因只在家蠶幼蟲期的中腸特異表達(dá)。芯片表達(dá)譜分析結(jié)果顯示,Ctlp基因在大造雌雄共18個(gè)組織(器官)中的表達(dá)水平有顯著差異,特異性的幾乎只在中腸表達(dá)。
　　 RT-PCR組織表達(dá)譜和Real-Time PCR定量分析結(jié)果表明,Ctlp基因在家蠶Ys品種5L-3d幼蟲的中腸和生殖腺中均有表達(dá),