擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)無(wú)精子綜合癥家族相關(guān)基因DAZ的原核表達(dá)及組織定位.pdf

1、目的：為了更深入的研究DAZ基因與擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)生殖發(fā)育的關(guān)系，定位DAZ蛋白的表達(dá)位點(diǎn)以及分布特點(diǎn)，并以擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)作為模式生物研究高等生物甚至人類(lèi)的生育器官的發(fā)育奠定基礎(chǔ)，從分子水平掌握擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)的生長(zhǎng)特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)DAZ基因表達(dá)產(chǎn)物功能及分布規(guī)律的研究，將其作為靶分子研制核酸疫苗或者尋找它們的抑制物來(lái)研發(fā)新藥，通過(guò)控制該基因，減少或者阻止精子的生成，從而減少蟲(chóng)卵的產(chǎn)生，使其不能排除有效蟲(chóng)卵，對(duì)莫尼茨絳蟲(chóng)病的預(yù)防與控制都具有重要

2、意義。
　　方法：采用蘇木素染色法對(duì)絳蟲(chóng)蟲(chóng)體進(jìn)行染色、分離、鑒定出擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)。用TrizolReagent提取總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄酶PowerScript合成第一鏈cDNA，參照GenBank中登錄的擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)DAZ基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR技術(shù)合成并擴(kuò)增DAZ基因的保守結(jié)構(gòu)域序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體中進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序正確的序列用限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-D

3、AZ，轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后用SDS-PAGE及Westernblot分析表達(dá)產(chǎn)物。將純化后的產(chǎn)物免疫小鼠，免疫程序采用四次免疫，每十天一次，最后用眼球采血的方法收集血清。根據(jù)制備石蠟切片的步驟和方法制備擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)的石蠟切片，用收集的血清作為免疫組化的一抗進(jìn)行DAZ蛋白的組織定位。
　　結(jié)果：以擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)DAZ基因陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出大小

4、約405bp的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化，連接到pMD19-TVector上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，獲得含有DAZ基因ORF片段的克隆質(zhì)粒，PCR和雙酶切鑒定結(jié)果均顯示重組克隆質(zhì)粒pMD19T-DAZ構(gòu)建正確，測(cè)序結(jié)果證實(shí)目的片段序列插入正確。構(gòu)建的陽(yáng)性重組表達(dá)載體pET28a-DAZ轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主BL21（DE3）中，經(jīng)XholⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，獲得5369bp（pET-28a載體）與405bp的目的條帶，表明DAZ基因

5、ORF重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒pET28a-DAZ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE分析結(jié)果表明，在約14kd處出現(xiàn)與預(yù)計(jì)大小一致的條帶，證明重組蛋白表達(dá)成功。擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)全蟲(chóng)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別用重組蛋白免疫小鼠制備的高免血清和非免疫小鼠血清（陰性對(duì)照）進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，結(jié)果顯示，擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)天然DAZ蛋白能被重組DAZ蛋白制備的陽(yáng)性血清識(shí)別，在約14kd處出現(xiàn)顯

6、色帶，證明該蛋白具有良好的抗原性。擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)石蠟切片的免疫組化結(jié)果清晰，準(zhǔn)確定位出DAZ蛋白主要分布在擴(kuò)展模擬次絳蟲(chóng)的成節(jié)和孕節(jié)內(nèi)，在幼節(jié)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)分布。
　　結(jié)論：本試驗(yàn)以扁形動(dòng)物門(mén)絳蟲(chóng)綱的擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)為研究對(duì)象，克隆并成功表達(dá)出無(wú)精子綜合癥相關(guān)蛋白。通過(guò)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白易和細(xì)胞的其它成分分離，有利于蛋白表達(dá)量的提高，且可以避免蛋白酶對(duì)外源蛋白的降解作用。免疫組化結(jié)果表明DAZ蛋白主要分布在雌性生殖器官