豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株NSP2基因遺傳變異及GM-CSF對(duì)GP3-GP5的免疫增強(qiáng)作用研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)屬于動(dòng)脈炎病毒科,基因組為單股正鏈RNA,具有快速變異特性。自1991年首次分離獲得病毒以來(lái),該病毒基因逐漸發(fā)生變化并伴隨著給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。2000年美國(guó)出現(xiàn)非典型PRRSV,免疫商品豬群和母豬群出現(xiàn)嚴(yán)重死亡。PRRS于1996年在我國(guó)首次爆發(fā),并逐漸傳播各省市。2006年在中國(guó)大陸地區(qū)多

2、省份出現(xiàn)高致病性PRRS,主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)高熱(41.0℃以上)、皮膚發(fā)紅,發(fā)病率和死亡率高。病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2上存在30個(gè)氨基酸缺失。近年來(lái),PRRSV持續(xù)流行,造成了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。為了深入闡明該病毒基因遺傳變異規(guī)律和NSP2毒力作用,探索該病毒新的免疫防控方法,本研究從華東地區(qū)部分省份2004-2009年發(fā)病豬群分離獲得38株P(guān)RRSV,并對(duì)其NSP2基因高變異區(qū)進(jìn)行了克隆和序列分析；根據(jù)基因分析結(jié)果,從中選擇4株

3、PRRSV流行毒株進(jìn)行仔豬人工感染發(fā)病試驗(yàn),研究NSP2基因變異與病毒毒力間的關(guān)系；同時(shí),設(shè)計(jì)構(gòu)建共表達(dá)PRRSV GP3和GP5與豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落細(xì)胞刺激因子(Granulocyte/macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)融合蛋白重組腺病毒,并進(jìn)行了小鼠和豬體免疫試驗(yàn),具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果分為以下5個(gè)部分:
　　 1.我國(guó)豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株分離與鑒定
　　

4、 2004-2009年在臨床流行病學(xué)研究基礎(chǔ)上,從江蘇、上海、山東、安徽、浙江和廣西等省市收集臨床發(fā)病豬場(chǎng)仔豬肺臟病料,經(jīng)勻漿、凍融和過(guò)濾處理后接種Macr-145或豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM),通過(guò)CPE觀察、RT-PCR檢測(cè)和PRRS陽(yáng)性抗體間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定,分離獲得38株P(guān)RRSV,其中,32株病毒直接采用Macr-145細(xì)胞分離獲得,其余6株病毒則是先用PAM細(xì)胞分離,然后接種Marc-145細(xì)胞分離獲得；分離病毒在Marc-1

5、45細(xì)胞上培養(yǎng)特性有一定差異,病毒毒價(jià)為103.75-106.33 TCID50/ml,為PRRSV研究提供了重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 2.2004-2009年豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株NSP2基因遺傳變異分析
　　 根據(jù)PRRSV NSP2基因設(shè)計(jì)合成2對(duì)PCR引物,采用巢式RT-PCR方法對(duì)上述分離的38株P(guān)RRSV NSP2基因高變區(qū)進(jìn)行克隆和測(cè)序分析,結(jié)果顯示:不同毒株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度有所不同,共出現(xiàn)5種長(zhǎng)度類

6、型,分別為:1215、1275、1287、1373和1374bp。38株P(guān)RRSV核苷酸同源性為71.6％-99.6％,推測(cè)的氨基脧?fù)葱詾?3.7％-98.3％。NSP2基因進(jìn)化分析結(jié)果顯示,38株分離株可以分為兩個(gè)基因亞型,即NSP2基因亞型Ⅰ和NSP2基因亞型Ⅱ,其中,NSP2基因亞型Ⅰ內(nèi)的毒株有28株,具有30個(gè)或更多個(gè)氨基酸的缺失,基因同源性為92.9％-99.2％；NSP2基因亞型Ⅱ內(nèi)的毒株具有1個(gè)或不具有氨基酸的缺失,但基

7、因差異較大,基因同源性為76.5％-99.6％。根據(jù)NSP2基因高變區(qū)基因缺失情況,38株P(guān)RRSV分離株分為5種類型,其中,30aa缺失型毒株比例最高(26/38),2種新的NSP2基因缺失類型的PRRSV毒株出現(xiàn)于2008年后。該研究結(jié)果表明,我國(guó)PRRSV流行毒株NsP2基因變異較大,并不斷出現(xiàn)新的變異毒株,加強(qiáng)PRRSV流行毒株基因變異監(jiān)測(cè)十分必要。
　　 3.豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2基因變異與毒力變化間的關(guān)系研究

8、
　　 根據(jù)上述PRRSV NSP2基因序列分析結(jié)果,選擇4個(gè)PRRSV毒株,包括YX0907、BB0907、SY0909和NT0801毒株,其中,YX0907、BB0907和SY0909毒株屬于基因亞型Ⅰ,具有30個(gè)氨基酸缺失的特征,NT0801屬于NSP2基因亞型Ⅱ,其NSP2上不存在缺失。GP5基因序列分析結(jié)果為:4株P(guān)RRSV毒株GP5基因同源性為98.0％-99.8％,其氨基酸同源性為97.5％-99.5％。選擇23頭

9、45日齡PRRSV、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和副豬嗜血桿菌(HPs)陰性健康商品仔豬,隨機(jī)分為5組,第1-4組分別頸部肌肉注射上述4株P(guān)RRSV分離株(第3代),2×104.32TCID50/1ml/頭,第5組3頭豬作為空白對(duì)照,隔離飼養(yǎng)21d,每天測(cè)量體溫,觀察臨床癥狀；攻毒后第7d、14d和21d采血分離血清,測(cè)定PRRSV含量；對(duì)死亡豬和第21天處死豬進(jìn)行病理解剖,觀察肉眼病理變化和組織病理變化,并進(jìn)行記分和比較,結(jié)果顯示,BB

10、0907毒株毒力最強(qiáng),試驗(yàn)豬感染后體溫明顯升高,臨床癥狀明顯,可引起3/5死亡,病豬肺臟組織具有明顯病理變化；YX0907毒株毒力較強(qiáng),試驗(yàn)豬臨床癥狀和病理變化明顯,可引起2/5死亡；NT0801毒力較弱,部分豬感染后出現(xiàn)1-2d體溫升高和輕度臨床癥狀,但未引起死亡；SY0909毒株毒力最弱,感染豬出現(xiàn)1-3d體溫升高,臨床癥狀不明顯,病理變化較輕；而對(duì)照組豬無(wú)臨床異常表現(xiàn)和病理變化。該研究結(jié)果表明,PRRSV分離株毒力存在明顯差異,4

11、個(gè)毒株毒力高低為:BB0907>YX0907>NT0801>SY0909。具有NSP2相同基因缺失類型的3個(gè)PRRSV分離株毒力差異較大,證實(shí)PRRSV毒力與NSP2的30個(gè)氨基酸基因缺失沒(méi)有直接聯(lián)系。
　　 4.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP3-GP5與豬GM-CSF融合基因重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定
　　 利用PCR擴(kuò)增出高致病性PRRSV SY0608分離株的GP3和GP5基因及豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)

12、基因,并按順序?qū)⑺鼈冞B入梭載體pShuttle-CMV,并在GM-CSF和GP3之間及GP3和GP5間分別插入FMDV2A基因和“AAGCTT”連接子,重組穿梭載體經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后用PmeⅠ線性化,然后電轉(zhuǎn)化入基因工程菌株大腸桿菌BJ5183內(nèi),與腺病毒骨架載體pAdEasy-1重組,獲得重組腺病毒質(zhì)粒。將重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切線性化,然后用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞,10d后獲得重組腺病毒,命名為rAd-GF35。用RT

13、-PCR方法檢測(cè),可以擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度約1.8kb的GM-CSF-GP3-GP5融合表達(dá)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；用豬抗PRRSV陽(yáng)性血清和小鼠免疫原核表達(dá)豬GM—CSF蛋白獲得的血清進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA),證明該重組腺病毒在293A細(xì)胞中可以表達(dá)GM-CSF和GP3-GP5目的蛋白；用Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示GM-CSF-GP3-GP5融合蛋白能夠正確表達(dá),且抗原性良好；豬骨髓細(xì)胞用感染rAd-GF35的PK-15細(xì)胞上清刺激,可以

14、表現(xiàn)明顯增殖并形成集落。該研究結(jié)果證明,本研究構(gòu)建的重組腺病毒rAd-GF35可以有效表達(dá)GM-CSF-GP3-GP5重組蛋白,并具有GM-CSF生物活性。
　　 5.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP3-GP5與豬GM-CSF融合基因重組腺病毒小鼠免疫特性研究
　　 取60只BALB/c小鼠,隨機(jī)分為4組,每組15只。第1和第2組分別背部皮下注射PBS緩沖液和野生型腺病毒(wtAd)作為對(duì)照組,第3和第4組分別于背部皮下注射重

15、組腺病毒rAd-GP35(表達(dá)GP3-GP5融合蛋白)和rAd-GF35(表達(dá)GM-CSF-GP3-GP5融合蛋白),接種劑量為1010TCID50/0.5ml/只,隔離飼養(yǎng)3周后用同樣方法加強(qiáng)免疫一次。首次免疫后不同時(shí)間,隨機(jī)抽取5只/組采血和取脾臟,分別檢測(cè)PRRSV特異抗體、淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)、IFN-γ和IL-4,結(jié)果為:第3-4組小鼠在免疫后21d,均可以檢測(cè)到PRRSV特異ELISA抗體產(chǎn)生,42d達(dá)到最高,抗體水平差異顯著(

16、P<0.05)；首次免疫后42d,rAd-GF35免疫組抗體最高可達(dá)1:128,平均效價(jià)為1:80,顯著高于rAd-GP35免疫組(1:32)(P<0.05):同時(shí),rAd-GF35免疫組小鼠淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(Stimulation Index,SI)平均值顯著高于rad-GP35免疫組(P<0.05)；rAd-GF35免疫組小鼠脾細(xì)胞經(jīng)PRRSV抗原體外刺激后,細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ平均含量為175pg/ml,IL-4平均含量為87

17、.3 pg/ml,而rAd—GP35免疫小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的含量只有117.3 pg/ml和46.5pg/ml,差異顯著(P<0.05)。該結(jié)果表明,重組腺病毒rAd-GF35誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫明顯高于重組腺病毒rAd-GP35,GM-CSF可以顯著增強(qiáng)GP3/GP5蛋白在小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)。
　　 6.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP3-GP5與豬GM-CSF融合基因重組腺病毒仔豬免疫保護(hù)效力研究

18、　　 取15頭2周齡的PRRSV、PCV2和HPs陰性健康商品仔豬,隨機(jī)分為3組,每組5頭,隔離飼養(yǎng)。第1和第2組肌肉注射重組腺病毒rAd-GF35和rAd-GP35,第3組同樣方法接種野生型腺病毒(wtAd)作為對(duì)照,接種劑量為5×1010.0TCID50/1ml/頭,間隔3周后用同樣方法加強(qiáng)免疫一次,免疫后不同時(shí)間采血,測(cè)定ELISA抗體和豬外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)增殖指數(shù)SI；首免后42d用PRRSV-SY0608強(qiáng)毒滴鼻,2

19、×104.0 TCID50/1ml/頭,每個(gè)鼻孔1 ml,攻毒后分別觀察臨床癥狀、PRRSV病毒血癥和病理變化,并進(jìn)行綜合記分和比較,結(jié)果為:免疫后21d,重組腺病毒rAd—GP35和rAd-GF35組ELISA抗體水平顯著高于wtAd,rAd—GF35組中和抗體水平最高可達(dá)1:10,平均效價(jià)1:7.6,而rAd-GP35免疫組最高為1:8,平均效價(jià)<1:5；免疫后42d,rAd-GF35免疫組PBMC增殖指數(shù)SI平均值顯著高于rad—

20、GP35免疫組(P<0.05)；rAd-GF35免疫組豬血清中IFN-γ與IL-4含量為276.2 pg/ml和312.7 pg/ml,顯著高于rAd-GP35免疫豬血中的94.6 pg/ml和242.5pg/ml(P<0.05)。攻毒后,rAd-GF35免疫組臨床癥狀明顯減輕,綜合評(píng)定數(shù)值為26.2,顯著低于rAd-GF35免疫組的44和wtAd組的82.2(P<0.05)；攻毒后7d,rAd-GF35、rAd-GP35和wtAd組豬

21、血清病毒含量分別為1.5×103.0、3.3×103.0和1.0×104.0個(gè)TCID50,三個(gè)組間差異顯著(P<0.05)。此外,對(duì)照組豬攻毒后出現(xiàn)明顯病理變化,包括肺臟出血、炎性浸潤(rùn)和肺泡損傷等,其次為rAd-GP35,而rAd-GF35無(wú)明顯病理變化。該研究結(jié)果證明,rAd-GF35免疫可以提供仔豬較好免疫保護(hù)作用。
　　 綜上所述,我國(guó)流行PRRSV毒株發(fā)生了新的變異,多種NSP2基因缺失類型病毒株同時(shí)存在,豐富了PRR