四種微孢子蟲差異蛋白組學(xué)分析及NbSwp7原核表達(dá).pdf

1、微孢子蟲(Microsporidia)是可以感染從無脊椎到脊椎動物幾乎所有動物的一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物,種類繁多,不但可以水平傳播,而且可通過胚胎向子代傳播,每年給世界上所有養(yǎng)蠶國家?guī)韲?yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　微孢子蟲具有基因組進(jìn)化慢而基因進(jìn)化快的特點(diǎn),因此,進(jìn)入后基因組時代后,學(xué)者們對微孢子蟲的研究焦點(diǎn)開始從基因轉(zhuǎn)向蛋白水平,而且研究發(fā)現(xiàn)微孢子蟲蛋白在其對宿主侵染過程中起著重要作用,尤其是孢壁蛋白和極管蛋白,蛋白質(zhì)組學(xué)

2、已成為微孢子蟲的一個重要的研究領(lǐng)域。本研究以家蠶微孢子蟲和桑尺蠖分離的微孢子蟲、藍(lán)螢葉甲蟲分離的微孢子蟲、家蠶分離的內(nèi)網(wǎng)蟲屬微孢子蟲為對象,采用雙向電泳及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),旨在解析家蠶微孢子蟲與其它三種微孢子蟲之間的蛋白組成差異。
　　家蠶微孢子蟲和桑尺蠖分離的微孢子蟲、藍(lán)螢葉甲蟲分離的微孢子蟲蛋白差異研究結(jié)果表明,三者總蛋白分布大體相似,但在蛋白點(diǎn)種類和數(shù)量上存在明顯差異。與家蠶微孢子蟲相比,桑尺蠖分離的微孢子蟲主要缺少一個PTP3

3、點(diǎn),而藍(lán)螢葉甲蟲分離的微孢子蟲則主要相對缺少多個PTP3肽段和一個NbSwp5點(diǎn),后二者的極管蛋白或孢壁蛋白的分子大小或結(jié)構(gòu)等可能與家蠶微孢子蟲的不同,桑尺蠖分離的微孢子蟲與家蠶微孢子蟲PTP3結(jié)構(gòu)和組成可能略有差異,而藍(lán)螢葉甲蟲分離的微孢子蟲可能缺少PTP3和Swp5或是這兩種蛋白的同源性很低。PTP3和NbSwp5都與孢子組織器官結(jié)構(gòu)組成和宿主侵染有關(guān),這3種微孢子蟲同為Nosema屬,但對家蠶的致病力有強(qiáng)弱之分,初步分析認(rèn)為以上這

4、2種蛋白與微孢子蟲的侵染性存在一定關(guān)系。除此之外,還有一些差異蛋白可能通過能量代謝、電子傳遞、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白修飾、DNA解旋及修復(fù)等途徑影響微孢子蟲的寄生、傳播等生命活動。
　　家蠶微孢子蟲與家蠶分離的內(nèi)網(wǎng)蟲屬微孢子蟲蛋白組成差異研究表明,它們的總蛋白分布完全不同,后者比前者主要缺少PTP3、幾種類似于家蠶微孢子蟲的孢壁蛋白、ATP酶和錳超氧化物歧化酶,它們分別參與孢子的結(jié)構(gòu)組成、宿主侵染、能量代謝和維持體內(nèi)超氧離子濃度平衡;前者

5、比后者主要缺少轉(zhuǎn)錄起始因子IIAγ-亞基、ATP依賴的RNA解旋酶、鋅依賴性氨肽酶、DNAJ類分子伴侶、翻譯延伸因子和ATP酶,它們分別參與孢子內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、能量代謝、蛋白降解和維持細(xì)胞穩(wěn)定等活動。這兩種微孢子蟲為不同屬種,對家蠶的致病力強(qiáng)弱也不同,可能它們各自在其蛋白水平上的分子大小或結(jié)構(gòu)等差別較大或同源性很低。家蠶分離的內(nèi)網(wǎng)蟲屬微孢子蟲可能缺少家蠶微孢子蟲中典型結(jié)構(gòu)的極管蛋白或孢壁蛋白,因而影響其對家蠶的侵染能力。除此之外,還有一

6、些差異蛋白可能通過深層次的基因或蛋白水平的調(diào)節(jié)等的不同途徑影響其各項(xiàng)生命活動。
　　家蠶微孢子蟲有很多孢壁蛋白,我們通過蛋白組學(xué)手段成功鑒定出一個家蠶微孢子蟲的孢壁蛋白NbSwp7,通過檢索分析,發(fā)現(xiàn)有關(guān)它的研究尚少,對其表達(dá)的研究尚未展開。本研究通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫搜索、基因克隆及核苷酸測序檢測等手段成功獲得NbSwp7的編碼基因,其大小為876bp,然后以PET-30a和大腸桿菌感受態(tài)為載體,利用雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化成功構(gòu)建出重組表達(dá)

7、質(zhì)粒,最后以1μmol/mLIPTG在30oС下誘導(dǎo)表達(dá)5h,SDS-PAGE和Western檢測后發(fā)現(xiàn)成功獲得表達(dá)產(chǎn)物,其大小略大于預(yù)測值,這可能是由于翻譯和翻譯后修飾過程中使得蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而造成的影響。
　　本論文通過對4種不同來源的微孢子蟲進(jìn)行蛋白組學(xué)比較的研究,發(fā)現(xiàn)不同種類微孢子蟲在蛋白組學(xué)上存在一定差異,尤其是一些與侵染性相關(guān)的蛋白如孢壁蛋白和極絲蛋白在結(jié)構(gòu)和組成上可能存在差異。本研究為微孢子蟲蛋白的種類、結(jié)構(gòu)、