山東省豬感染BVDV調(diào)查及BVDVE2基因的序列分析.pdf

1、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus BVDV)又稱牛病毒性腹瀉一粘膜病病毒(BVD一MDV)是瘟病毒屬主要成員之一，與豬瘟病毒(CSFV)、羊邊界病病毒(BDV)同屬于黃病毒科，瘟病毒屬。由于國(guó)內(nèi)還沒有商品化試劑盒能夠?qū)ωi血清中BVDV抗體進(jìn)行診斷，所以本實(shí)驗(yàn)以IDEXX公司針對(duì)牛的BVDV抗體檢測(cè)試劑盒中包被好的ELISA板為病毒抗原包被板，用兔抗豬瘟病毒（CSFV）高免血清阻斷其與CSFV抗原交

2、叉的位點(diǎn)，再以辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體為酶標(biāo)二抗，確定其最佳反應(yīng)條件，成功地建立了一種可用于檢測(cè)豬源BVDV抗體的復(fù)合捕獲阻斷ELISA方法。以該法對(duì)采自山東省淄博、臨沂、日照、濟(jì)南、泰安、濰坊、德州、七個(gè)地區(qū)共26個(gè)豬場(chǎng)866份豬血清樣品進(jìn)行BVDV抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示所檢血清中BVDV抗體陽(yáng)性率達(dá)到48％（416/866）。其中母豬和仔豬血清中BVDV抗體陽(yáng)性率分別為45.3％（101/224）和32.5％（20

3、9/642），豬場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá)88％。同時(shí)以豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)對(duì)部分血清樣品進(jìn)行CSFV抗體效價(jià)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)CSFV抗體效價(jià)為1∶64～1∶256的血清樣品其BVDV抗體多為陰性，而BVDV抗體呈陽(yáng)性者其CSFV抗體效價(jià)普遍較低（僅在1∶4～1∶16之間），這表明山東省豬群感染BVDV已較普遍，也揭示豬感染BVDV對(duì)豬瘟抗體的產(chǎn)生很可能存在抑制作用。
　　 本研究通過(guò)套式PCR方法，對(duì)臨床上58份豬瘟疑似病例樣品進(jìn)行BVDV檢測(cè)，結(jié)

4、果有5份呈BVDV陽(yáng)性，對(duì)BVDV陽(yáng)性樣品進(jìn)行其它臨床常見病毒的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4份CSFV呈陽(yáng)性，1份PRRSV陽(yáng)性、CSFV、PCV-2、PRV均呈陰性。我們將這1份BVDV（+）CSFV（—）PRRSV（+）的樣品接種到MDBK細(xì)胞上，得到一株穩(wěn)定遺傳的1型豬源BVDV，將其命名為JN-1。并通過(guò)克隆測(cè)序分析比較發(fā)現(xiàn)，這株病毒與王新平等分離到的國(guó)內(nèi)第一株豬源BVDVZM-95同源性達(dá)到92.6％，而與牛源BVDV同源性則較低。同時(shí)對(duì)用于

5、疫苗生產(chǎn)中培養(yǎng)細(xì)胞用的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口犢牛、胎牛血清進(jìn)行BVDV的RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率達(dá)到82％（14/17），對(duì)RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性血清進(jìn)行病毒分離，得到了1株能穩(wěn)定遺傳的可在MDBK上產(chǎn)生明顯病變的2型牛源BVDV，命名為JN-2。并對(duì)其進(jìn)行克隆純化和蝕斑實(shí)驗(yàn)，為下一步的豬體攻毒試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。E2囊膜糖蛋白是主要的保護(hù)性抗原，在受到病毒的自然感染或疫苗刺激時(shí)，宿主能迅速產(chǎn)生針對(duì)E2蛋白的中和性抗體，對(duì)JN-1和JN-2的 E2進(jìn)行