重慶地區(qū)羊傳染性膿皰與病原菌混合感染的檢測(cè)與分析

1、重慶地區(qū)羊傳染性膿皰與病原菌混合感染的檢測(cè)與分析許國(guó)洋1，付利芝1，徐登峰1，龍小飛2，陳朝洪2，李龍2，張素輝1（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌402460，2.重慶市武隆區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶武隆408500）摘要：要：采集山羊口唇部痂皮，通過(guò)PCR檢測(cè)、MDBK細(xì)胞培養(yǎng)、電鏡觀察、間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)對(duì)羊傳染性膿皰病毒進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，同時(shí)，分離培養(yǎng)病灶部位主要病原菌，進(jìn)行分子鑒定、致病性和藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，初步分析病原特性。結(jié)果表明，

2、共分離到1株羊傳染性膿皰病毒，3種病原菌，通過(guò)對(duì)病原菌16SrDNA基因序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其分別與多動(dòng)物鏈球菌、金黃色葡萄球菌和溶血性曼氏桿菌同源性較高，在系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)中分別與其聚為一簇。致病性分析，發(fā)現(xiàn)多動(dòng)物鏈球菌和溶血性曼氏桿菌對(duì)小鼠的致死率高達(dá)100%。3種病原菌主要侵染部位為小鼠心臟、肝臟和肺臟，能夠引起肺臟和肝臟明顯病變。藥敏試驗(yàn)表明，3種菌均對(duì)舒巴坦、阿米卡星和培氟沙星等6種藥物高度敏感。本研究首次從羊傳染性膿皰病變部位分

3、離到多動(dòng)物鏈球菌、金黃色葡萄球菌和溶血性曼氏桿菌，為該病在重慶地區(qū)的流行特點(diǎn)和防治技術(shù)研究提供了理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：羊傳染性膿皰；病原菌；混合感染；多動(dòng)物鏈球菌；金黃色葡萄球菌；溶血性曼氏桿菌中圖分類(lèi)號(hào)：中圖分類(lèi)號(hào)：S827；S855文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ADetectionanalysisofmixedinfectionofcontagiousecthymapathogenicbacteriaingoatsofChongqing

4、XUGuoyang1FULizhi1XUDengfeng1LONGXiaofei2CHENChaohong2LILong2ZHANGSuhui1（1.ChongqingacademicofsciencetechenologyChongqing402460China2.WulongDistrictBureauofAnimalHusbryChongqing408500China）Abstract:PCRdetectionMDBKcellcu

5、ltureelectronmicroscopyindirectimmunofluescence(IFA)werecarriedoutfthesystematicidentificationofcontagiousecthymaingoats.Thepathogenswereisolatedculturedidentifiedbymolecularidentificationpathogenicanalysisdrugsensitivit

6、ytestatthesametime.Theresultshowedthatonevirusstrainthreekindsofpathogenicbacteriaweresuccessfullyisolated.ThepathogenicbacteriarespectivelywereStreptococcuspluranimaliumStaphylococcusaureusMannheimiahaemolyticaaccdingto

7、the16SrDNAidentification.eachpathogenicbacteriafmedaseparatewiththecrespondingstrainsaccdingtothesystemdevelopmentofthe羊傳染性膿皰（goatcontagiouspustulardermatitis）又稱(chēng)羊口瘡，是由羊傳染性膿皰病毒引起的一種病毒性人畜共患病。羊傳染性膿皰病毒為雙鏈DNA病毒，屬于脊索動(dòng)物痘病毒科副痘病毒

8、屬，該病毒易感動(dòng)物為山羊和綿羊，主要引起羊只口唇、舌、乳房等部位出現(xiàn)膿皰和丘疹，后期形成痂皮，其被認(rèn)為是20個(gè)感染山羊和綿羊最重要病毒性疾病之一，可對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害[12]。重慶地區(qū)因其獨(dú)特的地形地貌和濕熱氣候，導(dǎo)致羊只疫病種類(lèi)日趨復(fù)雜，給疫病防控工作帶來(lái)巨大困擾，嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展。研究表明，羊傳染性膿皰可與病毒、支原體、衣原體等混合感染，因此，明確該病的病原，研究其混合感染情況對(duì)該病的致病機(jī)理研究和疫病防控十分關(guān)鍵[34]。通

9、過(guò)對(duì)重慶地區(qū)羊傳染性膿皰長(zhǎng)期臨床診斷，我們發(fā)現(xiàn)該病發(fā)展與創(chuàng)口部位細(xì)菌的混合感染相關(guān)聯(lián)，關(guān)于該方面的報(bào)道相對(duì)較少，本研究針對(duì)羊傳染性膿皰混合感染的主要病原菌進(jìn)行分離鑒定和致病性分析，為該病致病機(jī)理的進(jìn)一步探索奠定基礎(chǔ)，也為該病的防控技術(shù)研發(fā)提供了理論依據(jù)。1材料與方法材料與方法1.1主要試劑主要試劑細(xì)菌及病毒基因組提取試劑盒、2TaqPCRMasterMix和DL2000Marker均由天根生化科技(北京)有限公司提供；參照張素輝[5]的

10、方法設(shè)計(jì)細(xì)菌16SrDNA基因序列通用引物FR，依據(jù)NCBI中公布的羊傳染性膿皰病毒F1L基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物F1R1，引物由上海生物工程有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。表1引物序列信息引物序列信息名稱(chēng)序列信息(53)產(chǎn)物大小bp細(xì)菌通用引物F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAGR:ACGGCTACCTTGTTACGACTT1500F1L基因序列引物F1：ATGGATCCACCCGAAATR1：TCACACGATGGCCGTGA

11、C7081.2試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康昆明種小鼠，體質(zhì)量為18~25g，雌雄各半，購(gòu)自西南大學(xué)榮昌校區(qū)；患病羊只為重慶某區(qū)縣養(yǎng)殖場(chǎng)羊傳染性膿皰疑似病例。1.3病毒的病毒的PCR鑒定鑒定利用病毒基因組提取試劑盒提取疑似病例口唇部痂皮組織基因組，進(jìn)行羊傳染性膿皰病毒特異性序列PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送往生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。1.4電鏡觀察及間接免疫熒光電鏡觀察及間接免疫熒光病毒接種單層MDBK細(xì)胞