抗豬氨基肽酶單克隆抗體的制備及阻斷氨基肽酶受體功能的分析.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)和豬傳染性胃腸炎(TransmissibleGastroenteritis，TGE)這使兩種病毒是哺乳仔豬高致死率的主要原因，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如何有效防治這兩種疾病是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題，而對(duì)相關(guān)致病機(jī)理的研究可為有效防治提供理論依據(jù)。豬氨基肽酶(porcine aminopeptidaseN，pAPN)是一類鋅離子依賴性的膜結(jié)合Ⅱ型金屬糖蛋白，存

2、在于細(xì)胞表面，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的多種組織細(xì)胞的表面，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸膜、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞、腎近曲小管上皮和肺臟細(xì)胞表面都有高水平的表達(dá)，尤其在小腸微絨毛表面大量存在，主要功能是水解肽、酰胺等結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵，從而釋放出不同的N-中性氨基酸。APN作用的天然底物包括血管作用肽、神經(jīng)肽激素、細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑等，因此它能參與很多重要過(guò)程的深度反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，PEDV和TGEV均以pAPN作為細(xì)胞感染受體，同時(shí)pAPN的抗體可以有效阻斷

3、pAPN與PEDV和TGEV的結(jié)合。因此，制備抗pAPN抗體及對(duì)其生物學(xué)特性的分析可以為有效防治PED和TGE提供理論依據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　本研究以天然pAPN蛋白免疫BALB/c小鼠，按常規(guī)方法進(jìn)行融合，通過(guò)間接ELISA方法篩選，最終獲得2株抗pAPN的雜交瘤細(xì)胞系（命名為3E5和2E3），這兩株細(xì)胞分泌的抗體亞類分別為IgG1和IgM，效價(jià)分別為1∶1000和1∶500。通過(guò)Western blot證實(shí)3E5株和2E3株分泌

4、的抗體是針對(duì)pAPN的SPC段（pAPN500aa-963aa段），且與天然pAPN可發(fā)生特異性結(jié)合，免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)3E5株和2E3分泌的抗體可以與IEC-2細(xì)胞和PK-15細(xì)胞上的天然pAPN蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。將抗pAPN的單克隆抗體與IEC-2細(xì)胞和PK-15細(xì)胞作用后，再分別感染PEDV和TGEV，于接毒后24h、48h、72h在顯微鏡下觀察病變效果，結(jié)果表明，抗pAPN的單抗可有效阻斷pAPN受體，且IEC-2細(xì)胞和PK-1

5、5細(xì)胞病變均被不同程度的抑制。進(jìn)一步收取吸附后、病毒感染24h和病毒感染48h的細(xì)胞感染物，提取RNA，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，并對(duì)這三組樣品進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果表明，經(jīng)pAPN單克隆抗體作用后，細(xì)胞感染物中的病毒拷貝數(shù)顯著降低，表明抗pAPN單抗有效地阻斷了pAPN受體與病毒的結(jié)合，并進(jìn)一步抑制了病毒的繁殖。將pAPN單克隆抗體分別做1∶10、1∶100和1∶1000倍稀釋，將不同稀釋度的pAPN單抗分別與IEC-2細(xì)胞和P

6、K-15細(xì)胞作用后，再接種PEDV和TGEV，于病毒吸附后，收取細(xì)胞感染物，提取RNA，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，檢測(cè)分析不同濃度pAPN單抗對(duì)pAPN受體的阻斷作用。結(jié)果表明，不同濃度的pAPN單抗都具有阻斷pAPN受體，抑制pAPN受體與病毒結(jié)合，從而抑制病毒在細(xì)胞中的吸附的能力，且隨著單抗?jié)舛鹊慕档妥钄嘧饔靡搽S之降低。此外，將抗pAPN的單克隆抗體與IEC-2細(xì)胞和PK-15細(xì)胞作用后，再分別感染不同拷貝數(shù)的PEDV和TG

7、EV，于病毒吸附后，收取細(xì)胞感染物，提取RNA，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，檢測(cè)分析pAPN單抗對(duì)pAPN受體阻斷后對(duì)不同濃度病毒增殖的抑制作用。結(jié)果表明，pAPN單抗對(duì)不同濃度的病毒都具有阻斷作用，且不同濃度病毒組pAPN單抗對(duì)pAPN受體的阻斷作用并無(wú)明顯差異。
　　以上結(jié)果證明，3E5株和2E3株分泌的抗體對(duì)pAPN具有較高的特異性和親和性，3E5株可有效阻斷pAPN受體與TGEV的結(jié)合，并抑制TGEV在細(xì)胞中的感染和