鎳柱分離純化

1、鎳柱分離純化固定金屬離子親和柱主要用于金屬螯化離子。位于許多蛋白中的組氨酸殘基將會和許多金屬離子，例如鋅。銅，鎳，鐵等形成復(fù)合物。因此，該柱料能選擇性螯合一些具有組氨酸殘基的蛋白質(zhì)。但是半胱氨酸和咯氨酸殘基也能和固定化金屬螯和。但是親和力比組氨酸要弱。所以，結(jié)合的強(qiáng)度是和緩沖液的PH和金屬離子決定的。金屬螯和柱料主要是由亞氨基的乙酰乙酸成分耦聯(lián)瓊脂糖柱料，借助醚長生7個原子的空間。全部容量：2430um的含有zn的干膠柱料結(jié)構(gòu)：6%的高

2、鉸鏈的瓊脂糖柱料大?。?5165um平均微粒：90um直流速度：25度0.1MPa30倍柱床5厘米高度每小時可達(dá)700厘米最大壓強(qiáng)：0.3MPaPH變化：長期313短期214化學(xué)穩(wěn)定：通用含水緩沖液0.01M鹽酸，1.0MNAOH20%乙醇（保存7天）物理性質(zhì)：可以忽略在PH或者離子變化下的體積變化耐熱性能：121度下0.1M乙酸鈉作用半小時金屬螯和柱料保存于事先填充于20%乙醇。所以要攪拌驅(qū)除20%乙醇溶液。換成去離子水。比例是25%

3、去離子水和75%處理膠。處理金屬螯和柱料：1平衡所有用到的材料于室溫。2攪拌金屬螯和柱料3倒水進(jìn)柱子，驅(qū)除氣體。用無離子水液封幾厘米。4將金屬螯和柱料連續(xù)倒進(jìn)柱子，用玻璃棒支撐柱壁防止氣泡形成。5然后立即用無離子水液封，裝上柱蓋，連接上泵。6打開柱子底部的開關(guān)，然后調(diào)節(jié)泵的流速。通常是不超過0.3MPa的。7經(jīng)過一個穩(wěn)定的柱床填鴨后，維持填壓速度為3個柱床。使用adapt1經(jīng)過上溯填鴨后，關(guān)閉柱床下面開關(guān)，移開上面的薄膜，小心的加上去離

4、子水進(jìn)行液封。2一定角度插入adapt，確保沒有氣泡。3確保所有的連接都沒有問題，柱子泵樣品接受器4傾斜插入活塞確保沒有氣泡和管道充滿液體。利用活泵正反向的流動確保沒有氣泡。5固定adapt，打開柱子開關(guān)，開始緩沖液的流動。先以填鴨的速度直到柱床穩(wěn)定后。固定金屬離子：金屬螯和柱料通過水來螯和金屬的，避免發(fā)生沉淀在膠上。1確保柱子已經(jīng)平衡好。如果有必要可以洗2個柱床（去離子水）2選擇金屬離子和0.10.3M中弱性酸。例如鐵離子PH3左右就

5、好，避免形成沉淀和共沉。3加入一倍柱床的金屬離子溶液45倍柱床的去離子水洗滌5至少2倍柱床的平衡緩沖液結(jié)合：發(fā)生于PH5.58.5之間.最強(qiáng)反映發(fā)生于最后4再洗兩次柱料（一共35柱床去離子水）5最后用一倍體積起始緩沖液充旋柱料（20mMNa2HPO40.5MnaCl10mM咪唑PH7.4）利用離心來純化：上樣：1在起始緩沖液中加入樣品，然后使整體膠濃度達(dá)到50％2親柔攪拌，室溫離心5－30分鐘，結(jié)合能力取決于蛋白和樣品濃度。3500g離

6、心2－5分鐘，沉淀柱料。4取出上清。部分用于SDSPAGE蛋白電泳洗膠：1加入5倍體積起始緩沖液，攪拌5分鐘2500g離心2－5分鐘，沉淀柱料。3取出上清。部分用于SDSPAGE蛋白電泳4再洗兩次柱料（一共35柱床起始緩沖液）。記得取出上清，部分用于SDSPAGE蛋白電泳洗柱：1加入2倍體積洗脫緩沖液（20mMNa2HPO40.5MnaCl10mM咪唑PH7.4）攪拌5分鐘2再次500g離心2－5分鐘，沉淀柱料。3再洗四次柱料（一共52

7、柱床洗脫緩沖液）。記得取出上清，部分用于SDSPAGE蛋白電泳，280nM吸光值，ELISAWESTERN利用流速和重力純化：1在柱子底部加上濾器2加水排氣3加柱帽，去除殘余水。推薦是最多2Ml柱料就可以了樣品結(jié)合：1倒膠進(jìn)入柱子2小心上樣，用波棒室溫攪拌5－30分鐘3打開柱帽，收集流出峰用于分析洗膠：1加入5倍體積起始緩沖液，收集流出液用于SDSPAGE蛋白電泳2再洗兩次柱料（一共35柱床起始緩沖液）。記得取出上清，部分用于SDSPA

8、GE蛋白電泳洗柱：1加上柱帽，加入2倍體積洗脫緩沖液（20mMNa2HPO40.5MnaCl10mM咪唑PH7.4）攪拌5分鐘。打開柱帽，收集流出峰2再洗四次柱料（一共52柱床洗脫緩沖液）。記得取出上清，部分用于SDSPAGE蛋白電泳，280nM吸光值，ELISAWESTERN注意：0.5M咪唑的280nM吸光值＝0.5常見問題：1樣品太粘稠答：核酸存在影響，可以繼續(xù)超聲，加入RNA酶至10ugmlDNA酶至5ugml。然后冰浴10－1