hre,2.grp78嵌合啟動子調(diào)控vp,3表達進行鼻咽癌5alapdt基因治療的研究

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文HRE.Grp78嵌合啟動子調(diào)控VP表達進行鼻咽癌5-ALA-PDT/基因治療的研究姓名：李晉蕓申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：耳鼻咽喉科指導(dǎo)教師：趙素萍20080501博士學(xué)位論文 中文摘要研究結(jié)果1 ) 成功地構(gòu)建了四種重組質(zhì)粒載體即：P c D N A 3 ．1 ( 一) G r p 7 8 p ．V P 3 一M y c ．C M V , P c D N A 3 ．1 ( - ) H r e 2 ．G r p 7 8

2、 p ．V P 3一M y c - C M V ，P c D N A 3 ．1 ( 一) C M V ．V P 3 - M y c 以及P c D N A 3 ．1 ( - )V P 3 ··M y c ·- C M V2 ) 將四種載體成功地轉(zhuǎn)染至C N E ．2 細胞，在m R N A 及蛋白水平檢測到V P 3 基因在C N E ．2 細胞中均有表達；在轉(zhuǎn)染7 2 小時后，轉(zhuǎn)染P c D N A 3

3、．1 ( ．) C M V ．V P 3 ．M y c 的細胞存活率( 5 0 ．8 + 1 ．6 ) ％，明顯低于轉(zhuǎn)染P c D N A 3 ．1 ( 一) G r p 7 8 p ．V P 3 一M y c —C M V ( 6 4 ．1 + 1 ．4 ) ％，P c D N A 3 ．1 ( 一) H r e 2 ．G r p 7 8 p ．V P 3 - M y c —C M V ( 6 2 ．3 + 0 ．8 ) ％和P c

4、D N A 3 ．1 ( ·) V P 3 - M y c - C M V( 9 5 ．5 + 1 ．O ) ％細胞的存活率( P < 0 ．0 5 ) 。結(jié)果提示啟動子調(diào)控下的V P 3基因?qū) N E ．2 細胞具有一定的殺傷作用。3 ) 5 ．A L A 與C N E ．2 細胞培養(yǎng)產(chǎn)生了內(nèi)源性光敏劑原卟啉( P p I X ) ，P p l X 均勻分布在C N E ．2 細胞的胞漿中，胞核區(qū)未見分布。5 ．A

5、L A 產(chǎn)生的P p l X 在孵育6 小時后在胞漿的表達強度最高，尤以濃度為1 ．0 m m o l ／1 時為顯著。5 ．A L A 介導(dǎo)的P D T 對人鼻咽癌C N E ．2 細胞的殺傷作用隨著5 ．A L A 與C N E ．2 細胞孵育時間延長及5 ．A L A 濃度的增加而增加，在孵育6 小時，5 ．A L A 濃度為1 ．0 m m o l ／L ，激光功率為6 ．2 5 J ／c m 2 時，細胞存活率為( 2 3 ．

6、3 1 士1 ．5 9 ) ％，而單用激光時細胞存活率為( 9 6 ．4 2 士1 ．8 9 ) ％，單用光敏劑5 ．A L A 時細胞存活率為( 9 7 ．2 3 士2 ．0 1 ) ％。結(jié)果提示P D T 對鼻咽癌C N E ．2 細胞有較強的殺傷作用。4 ) 應(yīng)用P D T 聯(lián)合基因治療C N E ．2 細胞后，C N E ．2 細胞的存活率( 1 8 ．3 1 2 ．7 ) ％明顯低于單用基因治療( 7 4 ．4 土0 ．9 )

7、 ％和單用P D T 治療( 5 5 ．0 土2 ．2 ) ％的細胞存活率( P < O ．0 5 ) ；P D T 聯(lián)合基因治療后，細胞中V P 3 基因蛋白表達的強度明顯高于單用基因治療組和P D T 組( P <O ．0 5 ) ；P D T 聯(lián)合基因治療組內(nèi)，G r p 7 8 p 調(diào)控的V P 3 基因蛋白表達的強度明顯高于C M V 調(diào)控的V P 3 基因蛋白表達強度( P < O ．0 5 ) ；P D

8、T聯(lián)合基因治療后C N E ．2 細胞的凋亡率( 6 8 ．3 士2 ．3 ) ％明顯高于單用基因治療( 2 7 ．8 士1 ．6 ) ％和單用P D T ( 5 4 ．8 + 3 ．6 ) ％的細胞凋亡率( P < O ．0 5 ) ；形態(tài)學(xué)觀察顯示P D T 聯(lián)合基因治療組出現(xiàn)明顯的細胞壞死和凋亡。結(jié)果提示P D T 聯(lián)合基因治療對鼻咽癌C N E ．2 有更強的殺傷作用。研究結(jié)論：1 ) 首次成功地構(gòu)建了含H r e 2 反