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文檔簡介
1、· 5 1 8·中國藥理 學(xué)通報 C h i n e s eP h a r n u t c o l o g i c a lB u l l e t i n2 0 0 5M a y ; 2 1 ( 5 ) : 5 1 8 ~ 2 1G P C R . G 0 【 融合蛋白及其在 o G P C R s 配基篩選中的應(yīng)用 吳芳明, 劉永學(xué) ( 1 . 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理室, 北京1 0 0 8 5 0 ;
2、 2 . 江西中醫(yī)學(xué)院中藥系, 江西 南昌3 3 0 0 0 4 )中國圖書分類號 : R - 0 5 ; R3 4 1 . 3 ; R3 9 2 . 11 ; R9 7 7 . 6文獻(xiàn)標(biāo) 識碼 : A 文章編號 : 1 0 0 1 —1 9 7 8 ( 2 0 0 5 ) 0 5 — 0 5 1 8 — 0 4摘要: G P C R — G d融合蛋白是近幾年用于受體研究的新穎手 段 之一 , 它 的表達(dá)確保 了受體與 G蛋 白之 間
3、 1 :1 的化學(xué) 計(jì) 量關(guān) 系 、 空問位置 七 的鄰近性 及適 宜于 高通量 的配 基篩選 ,使其為孤兒 G蛋 白偶聯(lián)受體提供了一種新的研究策略, 將 在孤 兒受體 的配基 篩選 中 發(fā)揮 重要作 用 , 對 研 發(fā) 以 o G P C R為作 用靶點(diǎn)的新藥產(chǎn)生積極 意義。關(guān)鍵 詞 : 孤兒 G蛋 白偶聯(lián)受體 ; G蛋 白; 融合蛋 白; 配基篩選 G P C R — G a融合蛋 白( Gp r o t e i n — c o u
4、 p l e dr e c e p t o r —Ga l p h af u s i o np r o t e i n) 是近 l 0年來逐漸發(fā)展起 來 并用于受體研究的新技術(shù)。該技術(shù)將 G P C R基 因序 列 的 3端和 G基因序列的 5端融合連接 , 并將融 合基因在體外細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 中表達(dá) , 再通過制備含 有融合蛋白的膜總蛋白, 進(jìn)一步用于 G蛋白偶聯(lián)受 體 ( Gp r o t e i n — c o u p l e dr
5、 e c e p t o r s , G P C R s ) 相應(yīng)配基的 篩選及其它研究 。孤 兒 G蛋 白偶聯(lián)受體 ( o r p h a nGp r o t e i n — c o u p l e dr e c e p t o r s , o G P C R s ) 是一類 配基 及功 收稿 日 期 : 2 0 0 4— 1 0— 2 2 , 修回 日 期 : 2 0 0 4—1 2 — 0 9基金項(xiàng) 目: 國家 自 然科學(xué)基金 資
6、助項(xiàng) 目( N o3 0 1 7 1 0 9 6 ) ; 全軍 醫(yī)藥衛(wèi) 生 “ 十五” 面 E 資助項(xiàng) 目( N o0 1 M B 0 5 6 )作 者簡 介: 吳 芳 明 ( 1 9 8 1 一) . 男, 碩 士 , T e l : 0 1 0 4 5 6 9 3 2 2 5 2 .E . m a i l :w u f a n g m i n g0 _ 0 @ 1 6 3 . C O r l l ;劉永學(xué)( 1 9 6 6 一) ,
7、 男, 博士, 副研究員, 研究方向: 受體藥 理學(xué) 及新藥藥理 , 通訊 作者 , T e l : 0 1 0 4 5 6 9 3 2 2 5 2 , Em a i l : l i .u y x @ n i e . b mi . a e . c n能均屬未知的受體 , 是藥物作用的重要潛在靶點(diǎn) , 對 其配基的篩選確認(rèn)是新藥研 發(fā)的最關(guān)鍵環(huán)節(jié) , 也是 導(dǎo)致新藥發(fā)現(xiàn) 的基礎(chǔ)。。顯 然, 要從含有數(shù) 以千 、萬計(jì)的化合物庫中篩選 出孤兒
8、受體的特異性配基 ,就必須建立一個高通量 ( h i g h — t h r o u g h p u t ) 的配基篩 選體系。G P C R — G a融合蛋 白作為一個假 陽性反應(yīng) 發(fā)生率極低的高通量篩選體系 , 為孤兒受體的配基 篩選提供了一條簡便快捷 的途徑 。1G P C R - G o t 融合蛋白1 . 1G P C R · G o t融合蛋 白的基本 特征 G蛋 白偶 聯(lián)受體 因與 G蛋 白相偶聯(lián) 而得 名。G
9、蛋 白為雜合 三聚體, 由、 B和 ^ y 三個亞單位組成。一般認(rèn)為在 與 G P C R s 相偶聯(lián)的反應(yīng) 中, 以 O t 亞單位介導(dǎo)的作用 為主 , 由它作用引起產(chǎn)生第二信使 , 引發(fā)級聯(lián)放大反 應(yīng), 調(diào)節(jié)下游效應(yīng)器的功能活動 , 而 p 、 ^ y 亞單 位則 形成穩(wěn)定 的功能性 復(fù)合體起 輔助作用 。隨著受 體研究的 日益深入 , 對其研究逐漸 由定性 研究 向定 量研究過渡。由于不 同的細(xì)胞體 系 G P C R s 與其相
10、 偶聯(lián)的 G a蛋 白之間的化學(xué)計(jì)量 比各不相 同, 因此 , 在不同的細(xì)胞中 G P C R s 和 G蛋白亞單位的相互 作用的定量分析研究就缺乏一個共 同的衡量標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此 , 1 9 9 4年 , B e r t i n 等 首先成功構(gòu)建了共價連 接的 pR — G sO t 融合蛋 白, 由于該融 合蛋 白中 pR和 G sO t 在 化 學(xué) 計(jì) 量 上 的 1 : 1的關(guān) 系 , 使 之 在 G P C R s 和 G a的相
11、互作用的定量分析研究中發(fā)揮重 要作用。此后 G P C R — G a融合 蛋白在受體中的研究 也 不 斷 深 入。 1 9 9 9 年 , C o l q u h o u n等 總 結(jié) 出Th ed e v e l o p m e n to ft h er e v e r s a lo ft h et u m o rmu l t i d r u gr e s i s t a n c eDAIC h u n — l i n g .F U
12、L i . WU( C a r t c e rC e n t e r , S u nY a t — s e nU ) f v e r s i t ) ,G u a n g z h o u51 0 0 6 0 , C h i m t )A b s t r a c t : Mu l t i d r u gr e s i s t a n c e ( MD R) o ft u m o rc e l l sh a sb e c o met h e
13、ma i ni mp e d i me n tt h a ti n f l u e n c et h ec u r a t i v ee f f e c to fc a n c e rc h e mo t h e r a p y .Al t h o u g ht h e r ea r ema n yme c h a n i s msc a ng e n e r a t et h emu h i d m gr e —s i s t a n
14、 c e ,t h eo v e r e x p r e s s i o no fP — g l y c o p r o t e i ne n c o d e db yt h em u l t i d r u gr e s i s t a n c e 一 1 ( m d r 1 )g e n ei st h em a i nc a u s ei nt h ef o r ma t i o no fMDR.S e a c h i n gf
15、o ri n n o c u o u sa n de f f e c t i v er e v e r s a l0 fMDRi sn o to n l yame t h o do fi mp r o v i n gt h ee f ic i e n c yo fc a n c e rc h e mo t h e r a p yb u ta l —S Ot h ep r o b l e md e s i d e r a t e dt o
16、b er e s o l v e di nc h e n l o —t h e r a p yd o ma i n .Ke ywo r d s : mu l t i d m gr e s i s t a n ( ‘ e;P — g l y c o p r o t e i n:r e —v e r s a l ; t u mo r ; t h e r a p y維普資訊 http://www.cqvip.com · 5 2 0
17、·中國藥理 學(xué)通報 C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n2 0 0 5M a y ; 2 1 ( 5 )2 . 2 . 1 原理 當(dāng)前 , 一般認(rèn)為配基與 G P C R s 結(jié)合 會誘發(fā)后者構(gòu)象 的變化 , 使 G P C R s 處于活化狀 態(tài),活化的受體與 G蛋白相互作用 , 促使 G T P取代 僅亞 單位上所結(jié)合的 G D P , 僅與 p
18、亞單位解離 , 形成 G蛋白的活化形式 。在 G P C R s 和 G 僅共 同表達(dá)的完整 細(xì)胞 中, 由于配基調(diào)節(jié) 的 G T P結(jié)合的量非常低 , 一 般的方法很難檢測 到 G T P結(jié)合的量。而 當(dāng)激動劑 作用在 G P C R . G融合蛋 白上 時, B e r t i n等 發(fā)現(xiàn) ,由于 G P C R . G 僅融合蛋 白可以促進(jìn)二者之間更加有 效的偶聯(lián) , 增加 G T P與活化 了的 G 僅的結(jié) 合的量。因此 , 當(dāng)
19、用一種放射性元素 s 對 G T P進(jìn)行標(biāo)記 , 就 可以通過檢測與活化的 G 僅結(jié)合形式的 s ] G T P ~ S的放射性強(qiáng)度 , 進(jìn)而判 斷受體是否被配 基所激活?;诖?, 進(jìn)行配基篩選時 , 將化 合物作用 于 G P C R .G 僅融合蛋白上 , 通過檢測結(jié) 合形式 的 [s ] G T P ~ S與 G D P的量的變化關(guān)系, 即可判斷該化合物是否為 特異性配基 。2 . 2 . 2 方案 在得到 o G P C R
20、s 和 G 僅c D N A的基礎(chǔ) 上 , 借助 K O D聚合酶 , 經(jīng)過 P C R的擴(kuò)增反應(yīng), 表達(dá) 得到大量的含 o G P C R s 基 因序列 3端和 G 僅基 因序 列 5端連接的融合基因, 然后將融合基因與表達(dá)載 體進(jìn)行連接, 并把構(gòu)建載體轉(zhuǎn)至細(xì)胞使之表達(dá) o G .P C R . G 僅融合蛋 白, 由于該蛋 白表 達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞 膜 , 故提取膜蛋 白即可得到 o G P C R . G 僅融合 蛋 白。為了確定膜
21、制備中是 否含有 o G P C R . G 僅融合蛋 白,可用 We s t e r n印跡法進(jìn)行鑒定 。然后再進(jìn)行配基篩 選 , 簡言之 , 將化合物或組 織提取物與 G P C R . G 僅融 合蛋白在一定條件下共同孵育 , 待反應(yīng)完畢 , 通過檢 測反應(yīng)物中結(jié)合形式 [s ] G T P ~ S與 G D P的數(shù)量 以判斷受體蛋 白是否被檢測物結(jié)合并激活 , 從而確定 該孤兒受體的配基。目前, 在運(yùn)用 G P C R — G
22、僅融合蛋 白對 o G P C R s 進(jìn) 行配基篩選的工作中, 以日本學(xué)者 H a g a 所領(lǐng)導(dǎo)的課 題組的研究工作較為突出, 他們將 2 6個 o G P C R s 分 別與 G i 僅及 G s 僅亞單位形成融合蛋 白后 , 提取膜總 蛋 白, 而后利用含有近10 0 0 個化合物或組織提取物 庫與融合 蛋 白作 用, 通過 檢 測結(jié) 合 形 式 的 [s ]G T P ~ S 的量來進(jìn)行高通量的配基篩選 工作 , 并在其 中
23、發(fā)現(xiàn)了 l 5個類似于激動劑作用的化合物 、 一個反 向激動劑及 一個 內(nèi)源性 的激動 劑, 這 些工作 對 于o G P C R s 的去孤兒化及新藥發(fā)現(xiàn)工作有著極為重要 的意義, 同時也 說明運(yùn)用 G P C R — G 僅融 合蛋 白進(jìn)行 配基篩選是切實(shí) 可行的。2 . 2 . 3 優(yōu)勢與基于培養(yǎng)細(xì)胞的第二信使篩選模 式相 比, 運(yùn) 用 G P C R . G 僅融 合蛋 白進(jìn)行配基篩選有 如下優(yōu)勢 : ①易于得到大量包含融合蛋
24、白的膜制備 ;② s ] G T P ~ S結(jié)合反應(yīng)過程簡單且適宜于高通量 的篩選 ; ③激動劑、 拮抗劑及部分激動劑可以很容易地被區(qū)分開來; ④ 出現(xiàn)假陽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的概率非常 小 ; ⑤信 噪 比更 高 , 不 容易受 到外 界 因素 的干 擾 l 1; ⑥無需進(jìn)行大量細(xì)胞的培養(yǎng)。3 存在 問題及前景 G P C R . G 僅融合蛋白提 供 了一個新 的策略去研 究孤兒 G蛋白偶聯(lián)受體 , 與目前較 為成熟的第二信 使篩選手段互 為
25、補(bǔ)充。當(dāng)然, 由于 G P C R . G 僅融 合蛋白 自身的一些特點(diǎn) , 運(yùn) 用 G P C R . G 僅融 合蛋 白進(jìn) 行配基篩 選的 策略也存 在不少 的 問題 和劣 勢 : ① s ] G T P y S結(jié) 合實(shí)驗(yàn)對 G 僅 q偶聯(lián)受體并不適 用,同時 , 對與 G 儀 。偶聯(lián) 的受體 , 只能在完整的細(xì)胞 中觀測到s ] G T P ~ S的結(jié) 合; ② 由于在 G P C R . G 僅融 合蛋 白中是直接檢測 s ]
26、G T P , y S 的結(jié)合的量 , 而不 是檢測級聯(lián)放大反應(yīng)所 引起的信號, 所以融合蛋 白系統(tǒng)對配基濃度的敏感性不如以第二信使為檢測指 標(biāo)的完整細(xì)胞研究 ; ③結(jié)合動力學(xué)過程 尚待進(jìn)一 步 闡明。一般來說 , [s ] G T P ~ S與 G 僅亞單位結(jié)合 的量伴隨著 G D P的濃度升高而降低 。然而, D u p u i s等 在研究 s ] G T P ' y S 與活化的 G 僅亞單位 相結(jié)合的過程中發(fā)現(xiàn), 部
27、 分受體被活化后 , 活化型 G 僅亞單位與 s ] G T P y S 結(jié)合的量伴隨著 G D P濃度的 增加下降的程度很不明顯, 使得 s ] G T P ' y S與活化 的 G 僅亞單位之間的結(jié)合動力學(xué)過程不易描述 。這 對基于結(jié)合型[s ] G T P ~ S的量 的變化曲線 為基礎(chǔ) 判斷受體是否被活化的配基篩選研究極其不利。這 些問題亟待解決 在今后將 G P C R — G 僅融合蛋白技 術(shù)應(yīng)用于 o G P C
28、R s 的研究 中, 只要根據(jù)情況充分發(fā) 揮其優(yōu)勢 , 盡量避免該技術(shù)尚存在的不足, 并注重同其它 已有手段的結(jié)合運(yùn)用 , 取長 補(bǔ)短 , 那么 G P C R .G 僅融合蛋 白技術(shù)肯定會在 o G P C R s 配基篩選及其 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域的研究 中發(fā)揮重要作用, 因此具有 良好的應(yīng)用前景。參 考文獻(xiàn) :[ 1 ]劉永學(xué) , 余少平 孤兒 G蛋白偶聯(lián)受 體及其作為新藥靶點(diǎn) 的重要意義【 J ] . 中國藥理 學(xué)通報 . 2 0 0
29、 3 . 1 9 ( 6 ) : 6 0 1 — 4 .[ 2 j呂寶璋. 受體的 概論 [ M ] / / 呂寶璋 . 盧 建, 安明榜 主編.受體 學(xué). 合肥 : 安徽科學(xué)技 術(shù)出版社 , 2 0 0 0 : 3— 2 5 .3jWu r c hT ,P a u w e l sP J .An a l y t i c a lp h a r ma c o l o g yo fGp r o t e i n—維普資訊 http://www.
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