人oGPCRs-Gi1α融合蛋白的表達(dá)及GPR80的功能初探.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs),因介導(dǎo)細(xì)胞間通訊和細(xì)胞內(nèi)信息傳遞而具有重要的生理功能和病理意義。GPCR一直是最重要的藥物靶點(diǎn),也是藥理學(xué)研究的重要內(nèi)容。據(jù)測算,人類GPCR的總數(shù)在900個左右。其中,配基與功能均屬未知的GPCR,即孤兒GPCRs(orphan GPCRs,GPCRs),大約有100個左右。
　　鑒于GPCR的重要性,如何篩選確認(rèn)oGPCR的配基,進(jìn)而探索其功

2、能已成為oGPCR研究領(lǐng)域的關(guān)鍵內(nèi)容。前者,通常被形象地稱為oGPCR的“去孤兒化”(Deorphanization)。本研究主要包括兩部分:一是利用GPCR與G蛋白偶聯(lián)的特性,將幾個oGPCR分子與G蛋白亞基進(jìn)行融合并表達(dá)融合蛋白,為實(shí)現(xiàn)oGPCR的配基篩選奠定基礎(chǔ);二是對新近“去孤兒化”的GPR80受體進(jìn)行了功能初探。主要結(jié)果總結(jié)如下。
　　在本實(shí)驗(yàn)第一部分中,根據(jù)oGPCR數(shù)據(jù)庫的信息,分別克隆人孤兒受體成員GPR45(Ge

3、nBank Accession number: NM_007227),GPR85(GenBank Accession number:NM_018970),GPR174(GenBank Accession number:NM_032553)與Gi1a的完整編碼區(qū),測序完全正確后,通過重疊延伸(splicing by overlap extension, SOE)PCR技術(shù)將二者進(jìn)行融合,然后將融合基因克隆到供體質(zhì)粒pFASTBac1中,而

4、后轉(zhuǎn)化DH10Bac,使含融合基因的重組供體質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)的特異性轉(zhuǎn)座,得到重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒。將該重組桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲 sf9細(xì)胞,制備含有重組桿狀病毒母株的上清。利用合適滴度的病毒上清,感染 sf9細(xì)胞一定時間。經(jīng)Wester Blot檢測證實(shí),sf9細(xì)胞成功表達(dá)了相應(yīng)的oGPCRs-Gi1α融合蛋白。而且,在重組病毒感染強(qiáng)度(multiplicity of infection,moi)為5、感染時間為72h的條件下,各融合蛋白的表達(dá)含

5、量較為豐富。
　　在本實(shí)驗(yàn)第二部分中,我們探討了GPR80受體在腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transdifferentiation, EMT)中的可能作用。GPR80是新近實(shí)現(xiàn)“去孤兒化”的oGPCR成員。我們選擇人近端腎小管上皮細(xì)胞系HK-2細(xì)胞為研究對象,分別在低糖(5mM)和高糖(30mM)條件下探索TGFβ-1與EMT的關(guān)系。然后利用TGF-β1(5ng/ml)誘發(fā)的HK-2細(xì)

6、胞 EMT病變模型,著重觀察了高糖(30mM)條件下a-酮戊二酸鈉對HK-2細(xì)胞EMT病變的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),a-酮戊二酸鈉在100和500μM時均明顯抑制EMT病變的發(fā)生發(fā)展,表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)顯著升高(P<0.01),間葉組織標(biāo)志物 Vimentin表達(dá)顯著降低(P<0.01),此過程還伴隨著其受體GPR80的表達(dá)上調(diào)。本發(fā)現(xiàn)結(jié)果首次證實(shí),a-酮戊二酸鈉具有逆轉(zhuǎn)EMT的作用,預(yù)示著a-酮戊二酸(鹽)及其受體介入了