吲哚3-草酰胺衍生物YB-L12的抗腫瘤作用及其作用機(jī)制研究.pdf

1、吲哚3-草酰胺衍生物D-24851是德國ASTA公司開發(fā)的一種新型、具有抗腫瘤活性的小分子化合物，它能夠抑制微管聚合并將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對多種惡性腫瘤細(xì)胞都有活性，體內(nèi)試驗(yàn)中，治療劑量無神經(jīng)和血液毒性，口服有效，現(xiàn)已進(jìn)入臨床I期實(shí)驗(yàn)?？赏蔀榕R床上潛力巨大抗腫瘤藥物。本實(shí)驗(yàn)室從天然產(chǎn)物中引入活性基團(tuán)，合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎且抗腫瘤活性較好的吲哚3-草酰胺衍生物，其中YB-L12為從天然產(chǎn)物胡椒胺中引入活性胡椒芐基，

2、合成的吲哚3-草酰胺衍生物，在體外有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，且具有良好的量效關(guān)系。本文進(jìn)一步研究了YB-L12對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞和動物移植性腫瘤的抑制作用及特點(diǎn)，并初步探討了它的作用機(jī)制。 1.YB-L12的體外抗腫瘤作用本文通過MTT、SRB實(shí)驗(yàn)法發(fā)現(xiàn)YB-L12對多種腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用，IC50為0.10～9.41μM。但單從MTT結(jié)果來看，YB-L12對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞選擇性不強(qiáng)，對人血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)及人疤痕

3、成纖維細(xì)胞(fb)的IC50分別為1.20μM和2.40μM。從SRB結(jié)果可看出：YB-L12對人紅白血病細(xì)胞(K562)及阿霉素誘導(dǎo)的多藥耐藥株(K562/AO2)均有抑制作用，GI50分別為：1.70μM和0.94μM。通過對Hela、SKOV3細(xì)胞生長曲線的觀察，發(fā)現(xiàn)不同濃度的YB-L12對腫瘤細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，并且具有顯著的量效關(guān)系。 2.YB-L12的體內(nèi)抗腫瘤作用體內(nèi)移植腫瘤實(shí)驗(yàn)亦觀察到Y(jié)B-L12對小鼠實(shí)

4、體型肉瘤S180有一定的治療作用。連續(xù)灌胃給予YB-L12(75mg/kg/d 及150mg/kg/d)6天，對小鼠肉瘤S180的生長抑制率分別為34.89％和47.60％，高劑量組和低劑量組瘤重均比空自對照組小(P＜0.01)，而低劑量組與高劑量組瘤重相比無差異(P＞0.05)，但給藥組小鼠的體重較空白對照組無明顯的下降(P＞0.05)，說明YB-L12在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出良好的腫瘤抑制作用，且治療劑量下無明顯系統(tǒng)毒性。 3.YB

5、-L12對腫瘤細(xì)胞周期的影響本文采用流式細(xì)胞儀分析了YB-L12對Hela細(xì)胞周期移行的影響。用不同濃度的YB-L12(0.2～0.8μM)分別作用于細(xì)胞12和24小時(shí)。YB-L12可使細(xì)胞周期阻斷在G2/M期。 4 YB-L12誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡YB-L12能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。不同濃度的YB-L12(0.2～0.8μM)作用于Hela和SKOV3細(xì)胞24小時(shí)后，分別用Giemsa染液和熒光染料Hoechst 33342對

6、細(xì)胞進(jìn)行染色，前者將細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，胞漿染成粉紅色。未加藥組的細(xì)胞核染色均一、結(jié)構(gòu)完整，可見分葉核；給藥組細(xì)胞呈現(xiàn)核膜皺縮，核碎裂。后者在紫外光激發(fā)下發(fā)藍(lán)色熒光，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)YB-L12可使細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生聚集、碎裂，細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，進(jìn)而斷裂，細(xì)胞膜不斷出芽、脫落，細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小不等的凋亡小體，并且隨著YB-L12濃度的加大，鏡下這種細(xì)胞形態(tài)的變化愈加明顯，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加。在DNA凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中，用不同濃

7、度的YB-L12(0.1～0.8μM)分別作用于Hela和SKOV-3細(xì)胞24小時(shí)，提取DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)典型的“DNA梯子(DNA ladder)”圖譜。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞的DNA含量測定，可見經(jīng)不同濃度的YB-L12(0.2～0.8μM)作用于Hela細(xì)胞24小時(shí)后，出現(xiàn)一個(gè)“亞G1峰”，且凋亡細(xì)胞的比例隨著YB-L12濃度的升高而增加，呈一定的劑量依賴性。從以上四方面的結(jié)果可以認(rèn)為YB-L12能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡

8、。 5 YB-L12對凋亡相關(guān)基因p53、caspase-3、 bcl-2及bax mRNA水平的影響本文觀察了YB-L12對凋亡相關(guān)基因p53、caspase-3、bcl-2及bax mRNA水平的影響。RT-PCR結(jié)果顯示0.2～0.8μM YB-L12能升高p53、caspase-3、bax mRNA的水平，同時(shí)降低bcl-2 mRNA的水平，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示YB-L12誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用極可能依靠上調(diào)

9、了p53、caspase-3及bax mRNA的水平，同時(shí)下調(diào)凋亡抑制基因bcl-2 mRNA的水平，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。 6 YB-L12對微管的影響微管是由微管蛋白和微管相關(guān)蛋白構(gòu)成的蛋白質(zhì)多聚體。微管也是癌癥化療的靶點(diǎn)之一，不同濃度的YB-L12(0.2～0.8μM)作用于Hela細(xì)胞12小時(shí)后，通過微管免疫熒光法觀察YB-L12對微管形態(tài)的影響，可見對照組的Hela細(xì)胞，微管形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，有時(shí)單根微管的輪廓亦可清晰

10、辨認(rèn)；而用0.2μM YB-L12處理后微管結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，數(shù)量減少、斷片增多；高劑量0.8μM的YB-L12則使絕大部分微管結(jié)構(gòu)破壞，微管不再成束，僅在核周殘留少量點(diǎn)狀不規(guī)則熒光。陽性對照藥D-24851(0.1μM)處理后的細(xì)胞微管不再成束，斷裂成片斷，呈點(diǎn)狀不規(guī)則熒光，這與YB-L12處理后的細(xì)胞微管形態(tài)變化相似。而紫杉醇(0.01μM)處理后的細(xì)胞微管呈三個(gè)或多個(gè)區(qū)域聚集分布，這個(gè)結(jié)果與紫杉醇抑制微管解聚的作用相一致。由

11、此證明：YB-L12可以通過抑制微管蛋白聚合，影響腫瘤細(xì)胞紡錘體形成，來抑制細(xì)胞有絲分裂，其對微管的作用與D-24851相似。綜上所述，YB-L12結(jié)構(gòu)新穎，低毒性，且在體內(nèi)外能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長，在體外對多藥耐藥腫瘤細(xì)胞也有抑制作用；能將腫瘤細(xì)胞生長周期阻斷在G2/M期，同時(shí)通過影響癌基因p53、caspase-3、bax及抑癌基因bct-2 mRNA水平，抑制細(xì)胞微管聚合，影響紡錘體形成來阻止細(xì)胞有絲分裂，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡