簡(jiǎn)介：目的本文旨在建立刺五加種質(zhì)資源的化學(xué)及分子生物學(xué)的評(píng)價(jià)方法，對(duì)來源于不同產(chǎn)地、不同性別的刺五加種質(zhì)資源藥材的質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)研究，最終找到刺五加道地藥材及其種質(zhì)資源的遺傳學(xué)特性，并為對(duì)優(yōu)良種質(zhì)進(jìn)行強(qiáng)化奠定基礎(chǔ)。方法利用高效液相色譜HPLC法對(duì)來源于不同產(chǎn)地刺五加種質(zhì)資源藥材進(jìn)行化學(xué)評(píng)價(jià)，分別測(cè)定刺五加根和莖中刺五加苷B、綠原酸、異嗪皮啶和刺五加苷D四種活性成分的含量，并研究其與生態(tài)因子關(guān)系；對(duì)不同刺五加種質(zhì)資源進(jìn)行分子生物學(xué)評(píng)價(jià)，應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記RAPD方法找出不同產(chǎn)地刺五加種質(zhì)資源及不同性別刺五加種質(zhì)資源的遺傳學(xué)差異，并對(duì)雌性刺五加的特異分子標(biāo)記進(jìn)行克隆和測(cè)序，運(yùn)用序列特異性擴(kuò)增區(qū)域SCAR的方法對(duì)雌性刺五加樣品進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)論本研究結(jié)合化學(xué)、生態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)三方面對(duì)不同產(chǎn)地、不同性別刺五加種質(zhì)資源藥材進(jìn)行評(píng)價(jià)。將不同產(chǎn)地刺五加種質(zhì)資源藥材分為化學(xué)型、生態(tài)型和基因型。1三個(gè)化學(xué)型包括化學(xué)型Ⅰ東方紅，五常，綏棱。化學(xué)型Ⅱ密山，亞布力。化學(xué)型Ⅲ清河，伊春?；瘜W(xué)型的特點(diǎn)為刺五加苷B為四個(gè)成刺五加苷B、綠原酸、刺五加苷D、異嗪皮啶中的主成分。三個(gè)化學(xué)型除異嗪皮啶含量在密山產(chǎn)刺五加種質(zhì)藥材中略有不同外刺五加苷B、綠原酸、刺五加苷D、異嗪皮啶含量含量順序?yàn)榛瘜W(xué)型Ⅰ化學(xué)型Ⅱ化學(xué)型Ⅲ。結(jié)果顯示七個(gè)不同產(chǎn)地四個(gè)成分含量差異較大。以刺五加苷B、綠原酸、刺五加苷D、異嗪皮啶的含量為指標(biāo)，伊春產(chǎn)刺五加各成分的含量明顯高于其它產(chǎn)地。2三個(gè)生態(tài)型包括生態(tài)型Ⅰ東方紅；生態(tài)型Ⅱ綏棱、密山、亞布力；生態(tài)型Ⅲ伊春、清河、五常。年積溫與刺五加中活性成分相關(guān)性最高。生態(tài)型中年積溫順序?yàn)樯鷳B(tài)型Ⅰ生態(tài)型Ⅱ生態(tài)型Ⅲ。年積溫與刺五加苷B、綠原酸含量呈負(fù)相關(guān)，與異嗪皮啶和刺五加苷D含量呈正相關(guān)。年積溫為不同產(chǎn)地刺五加種質(zhì)資源藥材活性成分含量的主要影響因素。3三個(gè)基因型包括基因型Ⅰ密山，綏棱，亞布力，東方紅?；蛐廷虬ㄎ宄！；蛐廷蟀ㄇ搴?，伊春?；蛐瓦z傳距離順序?yàn)榛蛐廷窕蛐廷蚧蛐廷?。其中伊春產(chǎn)刺五加種質(zhì)資源藥材遺傳多樣性最高。4化學(xué)型、生態(tài)型和基因型三者之間的關(guān)系如下刺五加苷B含量高的刺五加種質(zhì)資源藥材與生態(tài)型Ⅲ和基因型Ⅲ的分類相吻合。刺五加苷B含量高的刺五加種質(zhì)在年積溫較低、年平均溫度較低而降雨量較高的區(qū)域出現(xiàn)頻率較高；且其遺傳多樣性較高。刺五加苷B為刺五加活性成分中的主成分，故可推斷環(huán)境因素為年積溫較低、年平均溫度較低而降雨量較高是優(yōu)質(zhì)刺五加種質(zhì)資源藥材的適宜環(huán)境參數(shù)。綠原酸含量高的刺五加種質(zhì)資源與生態(tài)型Ⅱ和基因型Ⅱ的分類相吻合，此種類型刺五加種質(zhì)資源具有高綠原酸含量，中等遺傳多樣性，各環(huán)境因素都較溫和的地區(qū)為綠原酸含量高的刺五加種質(zhì)資源藥材的適宜產(chǎn)區(qū)；刺五加苷D、異嗪皮啶的含量和環(huán)境因素分布趨勢(shì)尚不明確，有待于進(jìn)一步分研究。5本研究對(duì)雌性及雄性刺五加種質(zhì)資源進(jìn)行研究，首次獲得了雌性刺五加種質(zhì)資源所特異片段。進(jìn)行BLASTX分析證明該雌性刺五加種質(zhì)資源所特異片段與對(duì)植物氮代謝起決定作用之一的谷氨酰胺合成酶類蛋白家族成員之間的同源性較高。

簡(jiǎn)介：天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文垂體腺瘤分子生物學(xué)特征和手術(shù)治療的研究姓名馬林申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)外科學(xué)（神經(jīng)外科）指導(dǎo)教師張建寧20060601天津醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文第一部分前言第一部分NUCIEOSTEMN和ASPP2在垂體腺瘤組織的表達(dá)及意義前言垂體腺瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的10％。根據(jù)其生物學(xué)行為將垂體腺瘤分為非侵襲性與侵襲性垂體腺瘤。侵襲性垂體腺瘤組織學(xué)形態(tài)屬于良性，但卻具有某些惡性腫瘤的生長(zhǎng)特征，因全切率相對(duì)低，復(fù)發(fā)率較高，而備受重視。垂體腺瘤的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)涉及多步驟、多因素的過程，諸如遺傳素質(zhì)、基因的突變、下丘腦激素分泌等在垂體腺瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮不同的作用，但其具體發(fā)生機(jī)制仍不完全清楚。所以，探索垂體腺瘤的發(fā)病機(jī)制，研究垂體腺瘤的臨床特征，從而開發(fā)出新的判斷預(yù)后指標(biāo)和治療方法是十分必要的。大量研究表明P53基因突變?cè)趷盒阅[瘤的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，但垂體腺瘤組織學(xué)上是良性腫瘤，P53基因突變?cè)诖贵w腺瘤中的發(fā)生率非常低，野生型P53蛋白為何不能發(fā)揮作用阻止腫瘤的發(fā)生推測(cè)可能是一些參與P53功能調(diào)控的某些基因發(fā)生改變，進(jìn)而抑制P53的功能，引起P53生理功能的喪失。野生型P53功能的改變可能在垂體腺瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮更為重要的作用。最近發(fā)現(xiàn)的P53凋亡刺激蛋白印OPTOSISSTIMULATINGPROTEINOFP53，ASPP是一個(gè)蛋白質(zhì)家族，其成員有3個(gè)ASPPL、ASPP2和IASPP。它們與口53形成復(fù)合物后，對(duì)P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有不同的作用。ASPPL和ASPP2的作用都是增強(qiáng)P53的促凋亡基因啟動(dòng)子與DNA的結(jié)合，促進(jìn)P53凋亡基因啟動(dòng)子的活化，增強(qiáng)P53的細(xì)胞凋亡功能。而IASPP則是競(jìng)爭(zhēng)性地抑制ASPPL和ASPP2與相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制P53的抑癌功能。2002年，TSAI和MCKAY報(bào)道了一種新的P53結(jié)合蛋白NUCLEOSTEMIN，定位于干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，參與干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控，能維持干細(xì)胞的擴(kuò)增并抑制其向成熟細(xì)胞分化。這引發(fā)了對(duì)干細(xì)胞和腫瘤相關(guān)性的高度關(guān)注。研究表明肌CLEOSTCM證與P53存在相互結(jié)合作用，并且這種結(jié)合作用發(fā)生在核質(zhì)中?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)可以推斷一個(gè)假定的工作模型NUCLEOSTEMIN蛋白

簡(jiǎn)介：背景最近的研究已明確冠心病患者功能異常的心肌中有存活的慢性冬眠心肌。有效的血運(yùn)重建可使慢性冬眠心肌功能部分或完全恢復(fù)正常。慢性冬眠心肌的存在使患者左心功能持續(xù)低下、發(fā)生惡性心律失常、猝死的危險(xiǎn)大增。因此冬眠心肌已成為近年來冠心病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，但冬眠心肌形成的確切機(jī)制尚不完全清楚。一系列的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)MAPKSMITOGENACTIVATEDPROTEINKINASE絲裂素活化蛋白激酶家族參與了心肌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程，冬眠心肌中存在凋亡的心肌細(xì)胞；抗腫瘤壞死因子單克隆抗體預(yù)處理能明顯減輕心肌細(xì)胞凋亡程度，冬眠心肌局部收縮功能儲(chǔ)備與TNFATUMNECROSISFACTA腫瘤壞死因子A呈負(fù)相關(guān)。研究亦發(fā)現(xiàn)缺血心肌對(duì)糖的攝取明顯增加，心肌細(xì)胞中GLUT4GLUCOSETRANLSPTTYPE4葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子4、INOSINDUCIBLENITRICOXIDESYNTHASE誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶表達(dá)增加。這些研究均喻示了MAPKS、GLUT4、INOS、TNFA參與了慢性冬眠心肌的發(fā)生和發(fā)展。目的探討慢性冬眠心肌細(xì)胞內(nèi)MAPKS、TNFAMRNA、心肌細(xì)胞凋亡、GLUT4、INOS的變化和意義；探討慢性冬眠心肌細(xì)胞內(nèi)MAPKS與TNFAMRNA、心肌細(xì)胞凋亡、GLUT4、INOS的關(guān)系；探討慢性冬眠心肌細(xì)胞內(nèi)TNFAMRNA與心肌細(xì)胞凋亡、GLUT4、INOS的關(guān)系；初步揭示慢性冬眠心肌形成的分子生物學(xué)機(jī)制。方法行CABGCONARYARTERYBYPASSGRAFT冠脈搭橋術(shù)的冠心病患者10例，術(shù)前一周內(nèi)用DSEDOBUTAMINESTRESSECHOCARDIOGRAPHY多巴酚丁胺超聲負(fù)荷試驗(yàn)結(jié)合DTIDOPPLERTISSUEIMAGE多普勒組織成像確定冬眠心肌及正常心肌的存在部位，CABG術(shù)中根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行取材分別取正常心肌和冬日民心肌，并經(jīng)電鏡證實(shí)。取材心肌用免疫組化法TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，用免疫印跡法WESTERNBLOT檢測(cè)磷酸化的ERK、CJUN、P38及INOS、GLUT4的表達(dá)情況，原位雜交法ISH測(cè)定TNFAMRNA的活性。并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSSL20分析慢性冬眠心肌與正常心肌磷酸化ERK、CJUN、P38及TNFAMRNA、心肌細(xì)胞凋亡數(shù)、INOS、GLUT4是否存在差異；分析磷酸化的ERK、CJUN、P38與TNFAMRNA、心肌細(xì)胞凋亡、INOS、GLUT4的相關(guān)性；分析TNFAMRNA與心肌細(xì)胞凋亡、INOS、GLUT4的相關(guān)性。結(jié)果1慢性冬眠心肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK、CJUN、P38水平較正常心肌高；2慢性冬眠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)及TNFAMRNA、GLUT4、INOS的表達(dá)較正常細(xì)胞高；3慢性冬眠心肌細(xì)胞內(nèi)PERK與GLUT4相關(guān)P005相關(guān)系數(shù)R為0665；PCJUN與TNFQMRNA、慢性冬眠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)、GLUT4相關(guān)P005相關(guān)系數(shù)R分別為0816、0711、0801；PP38與TNFQMRNA、慢性冬眠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)、GLUT4、INOS相關(guān)P005相關(guān)系數(shù)R分別為0849、0637、0708、0676；TNFAMRNA與慢性冬眠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)、INOS相關(guān)P005相關(guān)系數(shù)R分別為0816、0657。結(jié)論1心肌缺血缺氧時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)TNFΑ分泌增加。2TNFΑ以及缺血缺氧均可觸發(fā)MAPKS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中活化的P38MAPK又可增強(qiáng)TNFΑ表達(dá)，這構(gòu)成了一個(gè)正反饋通路。3TNFΑ與MAPKS共同介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，MAPKS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促使心肌細(xì)胞增加GLUT4及INOS表達(dá)，促進(jìn)慢性冬眠心肌的形成。

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簡(jiǎn)介：研究背景與目的盡管近幾十年來人們對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等機(jī)制研究獲得了重要進(jìn)展但由于仍缺乏靈敏的早期診斷、高特異性的靶向治療以及實(shí)時(shí)有效的治療監(jiān)測(cè)惡性腫瘤依然是目前嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病。腫瘤診斷治療學(xué)TUMTHERANOSTICS是近些年提出來的一種腫瘤診治新策略其核心是將腫瘤治療與實(shí)時(shí)顯影有效結(jié)合引導(dǎo)醫(yī)生及時(shí)調(diào)整治療方案提高腫瘤病人的生存率和生活質(zhì)量為腫瘤個(gè)體化治療提供一種新途徑。由于制備同時(shí)具有腫瘤特異顯影與靶向治療作用的診斷治療劑THERANOSTICAGENTS是同步實(shí)現(xiàn)腫瘤診斷與治療的重要途徑因此近兩年就該類多功能抗腫瘤藥物的研發(fā)已成為繼分子靶向藥物后的新研究熱點(diǎn)。目前對(duì)于診斷治療劑的制備主要是通過兩種策略一是通過多步化學(xué)連接策略將腫瘤靶向配體如葉酸、多肽、抗體、核酸適配體等分別與造影劑和抗腫瘤藥物進(jìn)行連接從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向顯影與治療作用另一種是基于納米材料的特殊性質(zhì)如利用尺寸依賴性的腫瘤組織增透與阻滯EPR效應(yīng)或利用其比表面積大易于表面修飾各種靶向配體的優(yōu)點(diǎn)實(shí)現(xiàn)腫瘤藥物的被動(dòng)或主動(dòng)靶向遞送同時(shí)利用納米材料自身顯影特性或進(jìn)一步偶聯(lián)顯影劑實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向顯影與治療監(jiān)測(cè)。通過上述兩種策略目前已經(jīng)獲得了一些具有潛在應(yīng)用價(jià)值的診斷治療劑。例如99MTC標(biāo)記的阿霉素脂質(zhì)體已經(jīng)在進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)用于頭頸鱗癌病人的治療與監(jiān)測(cè)。然而通過多步化學(xué)連接策略制備診斷治療劑可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤配體靶向性的降低、顯影劑成像能力的減弱甚至藥物抗腫瘤活性的喪失。此外多步化學(xué)反應(yīng)與分離純化還可能增加制備成本。特別是基于多功能納米材料策略制備的診斷治療劑容易在內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)例如肝脾等組織器官沉積存在制備復(fù)雜、成本較高、潛在毒性等缺點(diǎn)其應(yīng)用也受到了很大限制。因此優(yōu)化診斷治療劑的制備方法或發(fā)展新的制備策略具有重要研究意義。七甲川花菁類化合物是一類兩端氮雜環(huán)中間含有多個(gè)次甲基長(zhǎng)共軛鏈的花菁小分子其具有摩爾吸光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)作為近紅外熒光探針已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蛋白與核酸標(biāo)記、基因測(cè)序、動(dòng)物活體成像以及臨床造影等。其中代表性分子吲哚菁綠ICG已經(jīng)在臨床上廣泛用于心臟、肝臟、眼底血管顯影等。最近我們課題組首次報(bào)道七甲川花菁熒光小分子IR780不需要化學(xué)連接腫瘤靶向配體即在多種腫瘤細(xì)胞及其荷瘤模型上顯示出良好的腫瘤靶向近紅外熒光顯影特性。進(jìn)一步亞細(xì)胞器共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IR780選擇性蓄積在腫瘤細(xì)胞的線粒體內(nèi)其親脂性離域型陽離子特性可能與其靶向腫瘤細(xì)胞線粒體密切相關(guān)。由于IR780具有良好的腫瘤選擇性和近紅外熒光顯影特性其也為腫瘤靶向診斷治療藥物的研究提供了新的思路和途徑?；谡n題組前期研究基礎(chǔ)本研究設(shè)想1IR780能否作為抗腫瘤藥物的新型靶向載體即通過化學(xué)連接策略將抗腫瘤藥物與IR780進(jìn)行共價(jià)連接能否獲得同時(shí)具有腫瘤靶向近紅外顯影與治療作用的多功能化合物2能否不經(jīng)過化學(xué)連接抗腫瘤藥物策略直接通過對(duì)IR780分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾通過類似物的合成與篩選獲得自身同時(shí)具有腫瘤靶向顯影與治療作用的新型多功能診斷治療劑為腫瘤診斷治療劑探索新的制備策略為腫瘤個(gè)體化治療提供新途徑。研究方法與結(jié)果為了驗(yàn)證上述假設(shè)獲得同時(shí)具有腫瘤靶向、近紅外熒光顯影與治療作用的多功能七甲川花菁分子本論文分三個(gè)部分開展研究主要結(jié)果如下1IR780羧基衍生物IR808的合成及腫瘤近紅外熒光顯影特性的鑒定11首先建立并優(yōu)化了該類七甲川花菁類熒光小分子的合成方法分別對(duì)合成該類七甲川花菁熒光小分子需要的三步反應(yīng)即VILSMEIERHAACK甲酰化、N烷基化、縮合反應(yīng)進(jìn)行了改進(jìn)。與以往文獻(xiàn)中報(bào)道的常用合成方法相比新建立的合成方法具有高效簡(jiǎn)潔、易大量制備等優(yōu)點(diǎn)為大量合成七甲川花菁熒光小分子、進(jìn)一步化學(xué)修飾與藥物連接奠定了基礎(chǔ)。12衍生合成了含有羧基官能團(tuán)的IR780衍生物IR808。鑒于IR780缺乏可供直接化學(xué)連接抗腫瘤藥物的活性反應(yīng)官能團(tuán)需要對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。本研究以6溴己酸為原料在合成IR780的反應(yīng)原料中引入羧基活性反應(yīng)官能團(tuán)成功合成了含有兩個(gè)羧基活性反應(yīng)官能團(tuán)的IR780衍生物IR808并經(jīng)過核磁共振氫譜1HNMR、碳譜13CNMR、高分辨質(zhì)譜HRMS測(cè)試確證其結(jié)構(gòu)。13IR808腫瘤靶向近紅外熒光顯影特性的鑒定。經(jīng)光譜測(cè)試發(fā)現(xiàn)IR808的最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)均在700900NM近紅外光譜區(qū)具有近紅外顯影特性和良好的血清穩(wěn)定性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明IR808在RTDMCS、HELA及LCC三種腫瘤細(xì)胞動(dòng)物荷瘤模型中均顯示出較好的腫瘤靶向性提示其用于腫瘤特異性顯影與診斷具有潛在應(yīng)用前景。研究結(jié)果表明IR808不僅保留了良好的腫瘤靶向近紅外熒光顯影特性同時(shí)還引入了兩個(gè)可供化學(xué)連接反應(yīng)的羧基官能團(tuán)為進(jìn)一步化學(xué)修飾、藥物連接或放射性核素標(biāo)記等奠定了基礎(chǔ)為獲得同時(shí)具有腫瘤靶向顯影與治療作用的多功能分子或經(jīng)放射性核素等標(biāo)記后用于深部組織腫瘤成像與診斷提供了可能性。2IR808與抗癌藥物的化學(xué)連接及其腫瘤顯影和殺傷活性的實(shí)驗(yàn)研究21成功地將IR808與臨床上常用的三種抗腫瘤藥物進(jìn)行了共價(jià)連接。利用IR808具有羧基活性反應(yīng)官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)特性選擇臨床上常用的分子量小、抗瘤譜廣、活性強(qiáng)但選擇性差的抗腫瘤藥物包括美法侖MELPHALAN、5氟尿嘧啶5FU、阿霉素DOX分別與IR808進(jìn)行化學(xué)連接獲得與美法侖的連接物IR808NM與5FU的連接物IR8085FU以及與阿霉素的共價(jià)連接物IR808DOX。前兩者獲得純品化合物其結(jié)構(gòu)經(jīng)過1HNMR及HRMS測(cè)試所確定。后者經(jīng)HRMS測(cè)試證明阿霉素與IR808連接成功但經(jīng)反復(fù)優(yōu)化反應(yīng)與純化條件未獲得純品IR808DOX。22對(duì)新合成的共價(jià)連接產(chǎn)物進(jìn)行腫瘤顯影與殺傷活性的評(píng)價(jià)。通過上述化學(xué)連接策略將IR808成功與抗腫瘤藥物連接并獲得純品的新共價(jià)連接物IR808NM、IR8085FU分別進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明IR808NM保留較好的腫瘤靶向特性但I(xiàn)R8085FU則失去了腫瘤靶向性。進(jìn)一步應(yīng)用MG63骨肉瘤細(xì)胞和SW480結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行IR808NM的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示IR808NM對(duì)兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性顯著高于對(duì)照藥美法侖。因此通過化學(xué)連接策略本研究成功獲得了同時(shí)具有腫瘤靶向顯影與治療作用的新型多功能熒光小分子IR808NM驗(yàn)證了IR780類似熒光小分子可作為抗腫瘤藥物靶向載體的設(shè)想。3IR808酯化衍生物的合成與抗腫瘤活性研究鑒于我們的研究和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道IR780和某些花菁類分子在較高劑量時(shí)可表現(xiàn)出一定的線粒體毒性本研究提出通過對(duì)IR808進(jìn)行酯化衍生化以提高親脂性使其更容易跨過磷脂雙層疏水性的線粒體膜從而增大其在線粒體的濃度及毒性可望獲得不需要化學(xué)連接抗腫瘤藥物自身具有腫瘤靶向、近紅外熒光顯影與抗腫瘤活性的新型多功能小分子。31IR808酯化衍生物的高效合成及其近紅外熒光顯影特性的鑒定。為了提高IR808親脂性顯著增強(qiáng)其進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體的濃度與毒性在IR808的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成四個(gè)IR808親脂性強(qiáng)的酯化衍生物包括丁酯IR808DB、己酯IR808DH、環(huán)己酯IR808DCH、苯酚酯IR808DP均為全新結(jié)構(gòu)的化合物未見文獻(xiàn)報(bào)道。所建立的合成方法具有高效、易于大量制備等優(yōu)點(diǎn)。四種IR808酯類衍生物在甲醇、DMSO、血清中的最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)均在近紅外區(qū)域具有比ICG更高的摩爾吸光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。32篩選獲得IR808DB具有顯著抗腫瘤活性。應(yīng)用人肺癌細(xì)胞A549研究發(fā)現(xiàn)IR808丁酯衍生物IR808DB具有最顯著的抗腫瘤活性IC50值為043ΜM。進(jìn)一步在乳腺癌細(xì)胞MDA231、MCF7、肝癌細(xì)胞SMMC7721HEPG2、肺癌細(xì)胞NCIH460等多種人類腫瘤細(xì)胞模型中評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性結(jié)果顯示IR808DB分子對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用IC5033IR808DB具有良好的腫瘤靶向顯影特性。近紅外熒光活體成像顯示IR808DB在大鼠RTDMCS荷瘤模型上顯示出腫瘤靶向特性離體臟器和腫瘤組織的近紅外熒光成像進(jìn)一步證實(shí)其在腫瘤組織的選擇性蓄積。研究還表明在荷瘤第4天肉眼未見明顯腫瘤包塊形成時(shí)荷瘤部位即可顯示出近紅外熒光顯影當(dāng)肉眼可見小于05CM的腫瘤包塊形成時(shí)荷瘤部位即具有顯著的近紅外熒光顯影特性提示IR808DB在腫瘤早期識(shí)別與診斷中可能具有研究?jī)r(jià)值。結(jié)論與創(chuàng)新本研究首先建立并優(yōu)化了IR780多種衍生物的化學(xué)合成方法制備了含有羧基官能團(tuán)的IR808證明其具有良好的腫瘤靶向近紅外熒光顯影特性為連接抗腫瘤藥物或放射性核素等顯影劑制備可用于深部組織腫瘤成像和具有腫瘤治療作用的多功能分子奠定了基礎(chǔ)。進(jìn)而利用IR808具有羧基活性反應(yīng)官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)特性成功地與三種抗腫瘤藥物進(jìn)行共價(jià)連接篩選獲得了同時(shí)具有腫瘤靶向顯影與殺傷作用的衍生物IR808NM驗(yàn)證了IR780類似熒光小分子可作為抗腫瘤藥物靶向載體的設(shè)想。最后通過對(duì)IR808進(jìn)行酯化修飾提高其親脂性從而增強(qiáng)其線粒體毒性制備獲得了不需要化學(xué)連接抗腫瘤藥物自身具有腫瘤靶向、近紅外熒光顯影與抗腫瘤活性的新型化合物IR808DB為進(jìn)一步研發(fā)新型的腫瘤個(gè)體化診斷治療藥物提供了新的策略和途徑。目前IR808DB已獲得國家發(fā)明專利授權(quán)其抗腫瘤機(jī)制與進(jìn)一步安全性評(píng)價(jià)等臨床前研究正在進(jìn)行中。

簡(jiǎn)介：戊型肝炎HEPATITISE，HE是由戊型肝炎病毒HEPATITISEVIRUS，HEV引起的一種急性病毒性肝炎，主要經(jīng)糞一口途徑傳播，常因飲用水源被污染而導(dǎo)致暴發(fā)流行，散發(fā)病例呈現(xiàn)全球分布。在我國的很多地區(qū)都有HEV感染的報(bào)道，HE流行率在我國為172％左右，各省市分布不均，農(nóng)村HEV感染率高于城市。根據(jù)HEV各分離株基因序列的核苷酸同源性、氨基酸同源性的大小以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析，目前將世界上HEV主要分為4個(gè)基因型。臨床上急性HEV感染率占總?cè)丝诘?5％～1％，感染率隨年齡增加而增加，20歲左右達(dá)到感染高峰，發(fā)病者主要為青壯年，其臨床表現(xiàn)主要是肝炎病毒引起的黃疸、急性肝壞死等。一般呈良性經(jīng)過，但孕婦感染情況較重，死亡率高達(dá)15％N25％，是一種全國普遍流行、危害比較嚴(yán)重的疾病。HEV是無包膜單股正鏈RNA病毒。HEV基因組全長(zhǎng)約72～76KB，由5’和3’非結(jié)構(gòu)區(qū)及3個(gè)相互重疊的編碼閱讀框OPENREADINGFRAMESFF1，F(xiàn)2和F3組成，基因組結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。其中F2編碼病毒衣殼蛋白，富含HEV重要抗原表位。HEV組織培養(yǎng)研究尚不成熟，目前的診斷主要是采用間接酶聯(lián)免疫吸附分析ELISA方法檢測(cè)血清中的抗體。但因?yàn)镠EV感染窗口期或患者自身免疫功能以及檢測(cè)方法的特異性等原因都會(huì)給HEV診斷帶來不確定性；HEVRNA檢測(cè)是目前判斷HEV是否存在的標(biāo)準(zhǔn)之一，但由于HEV存在多種基因型，給臨床研究工作和疫苗的研制帶來了很多困難。鑒于此，本課題建立了一種快速、敏感、特異性強(qiáng)的巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)NESTREVERSETRANIONPOLYMERASECHAINREACTION，NRTPCR方法，用于血清HEVRNA的定性檢測(cè)，并探討其在輔助臨床進(jìn)行戊型肝炎早期診斷中的價(jià)值。研究目的1、了解近年戊型肝炎病毒感染患者的臨床特征及血清學(xué)特點(diǎn)；分析比較單純感染和重疊感染的戊型肝炎患者的血清學(xué)特征異同，闡明重疊感染的戊型肝炎患者病情的發(fā)展及預(yù)后情況。為HEV的臨床診治和進(jìn)一步研究提供參考。2、建立巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增血清HEVRNA方法，評(píng)價(jià)其應(yīng)用于急性戊型肝炎患者血清HEVRNA檢測(cè)的臨床意義。研究方法1、收集667例戊型肝炎病毒HEV感染以及戊型肝炎病毒重疊感染患者的相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)并與乙型肝炎病毒HBV感染、丙型肝炎病毒HCV感染患者進(jìn)行回顧性資料分析。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2000年西安中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“病毒型肝炎防治方案”中的病毒型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。凡抗HEVIGM和或抗HEVIGG陽性，并具有急性病毒性肝炎的臨床表現(xiàn)和肝功能異常者，診斷為急性戊型肝炎。2、對(duì)GENBANK數(shù)據(jù)庫中的戊型肝炎病毒全基因組序列進(jìn)行分析比對(duì)，并針對(duì)國內(nèi)流行的戊型肝炎病毒株序列，選擇位于F2的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立NRTPCR方法，并檢測(cè)126例急性戊型肝炎患者、20例甲型肝炎患者、30例乙型肝炎患者和30例丙型肝炎患者血清中戊型肝炎病毒RNA，以30例健康獻(xiàn)血者作為對(duì)照組。全部樣品提取RNA后進(jìn)行NRTPCR檢測(cè)HEVRNA，并與檢測(cè)抗HEVIGM的方法進(jìn)行比較。研究結(jié)果1、HEV感染病例多分布在21～40歲年齡段；且女性多于男性。在HEV陽性患者中，青少年組與青年組、中年組，老年組在ALP項(xiàng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。老年組HEV感染患者的各項(xiàng)指標(biāo)都處于較高水平；HEV重疊感染患者的年齡高峰都是在21～40歲之間，低年齡組與高年齡組的多重感染率均較低。HEV感染組與HEVHBV重疊感染組比較，ALP、TBIL存在明顯差別，膽汁淤積增多，黃疸程度加深。HEV感染組與HEVHCV重疊感染組LDH差異顯著，肝細(xì)胞損傷明顯。2、126例急性戊型肝炎患者血清中有67例532％HEVRNA陽性。對(duì)照組血清HEVRNA檢測(cè)均為陰性。與血清抗HEVIGM檢測(cè)結(jié)果比較，HEVRNA檢測(cè)的總符合率為8091％102126，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性。NRTPCR方法檢測(cè)HEVRNA與血清抗HEVIGM檢測(cè)方法存在明顯的差異，不能相互替代，而有一定的互補(bǔ)性。3例患者的首份血清檢測(cè)為HEVRNA陽性，但抗HEVIGM為陰性，系列追蹤檢測(cè)，都相繼出現(xiàn)抗HEVIGM。急性戊型肝炎患者血清HEVRNA的檢出多在發(fā)病的1～12天內(nèi)。研究結(jié)論1、HEV主要侵犯青壯年，隨著年齡的增長(zhǎng)重疊感染的比例越高。老年人感染HEV的肝功能損害比年輕人嚴(yán)重；HEV陽性女性患者所占比例較多HEV重疊HBV感染后肝細(xì)胞損害加重，病情趨向重癥化。2、應(yīng)用巢式RTPCR方法能對(duì)急性散發(fā)戊型肝炎患者血清中的HEVRNA進(jìn)行定性檢測(cè)，且有較高的特異性和敏感性。在臨床使用可以提高對(duì)HEV早期診斷的水平，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

簡(jiǎn)介：白癜風(fēng)是一種色素脫失性皮膚病以表皮、粘膜和毛發(fā)的黑素細(xì)胞脫失形成的白斑、灰白發(fā)為主要癥狀其發(fā)病機(jī)制存在自身免疫學(xué)、氧化應(yīng)激學(xué)、神經(jīng)學(xué)以及遺傳學(xué)等多種假說。近年來國內(nèi)外大量研究表明白癜風(fēng)的發(fā)病與遺傳因素密切相關(guān)可能是一種多基因遺傳病。據(jù)報(bào)道INNVIT基因是與白癜風(fēng)患者的黑素細(xì)胞表達(dá)下調(diào)相關(guān)的新基因。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)INNVIT基因?yàn)槿鄙?1BP內(nèi)含子的FBXO11基因。為了探討INNVIT基因在黑素細(xì)胞中的生物學(xué)功能明確INNVIT基因在白癜風(fēng)中的作用本論文構(gòu)建了沉默INNVIT基因的SIRNA及INNVIT基因過表達(dá)載體P3XFP120研究INNVIT基因的抑制和過表達(dá)對(duì)黑素細(xì)胞生物學(xué)活性及酪氨酸酶輸出的影響。論文通過設(shè)計(jì)構(gòu)建了人工合成的特異性SIRNA同時(shí)構(gòu)建了該基因的過表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)分別轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞從而研究INNVIT基因抑制和過表達(dá)對(duì)黑素細(xì)胞生物學(xué)功能及黑素細(xì)胞酪氨酸酶表達(dá)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出的的影響。首先檢測(cè)了INNVIT基因MRNA和蛋白的表達(dá)SIRNA的抑制作用顯著降低了INNVIT基因MRNA和蛋白的表達(dá)量P3XFP120質(zhì)粒的過表達(dá)顯著增加了INNVIT基因MRNA和蛋白的表達(dá)量。其次INNVIT基因抑制和過表達(dá)對(duì)黑素細(xì)胞增殖、凋亡及遷移相關(guān)生物學(xué)功能的影響。采用SIRNA抑制和質(zhì)粒載體過表達(dá)后INNVIT基因的過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡INNVIT基因的抑制使黑素細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)從G0G1期到S期的細(xì)胞周期停滯現(xiàn)象極大地降低了細(xì)胞增殖和存活的能力同時(shí)顯著增加黑素細(xì)胞的早期凋亡水平。細(xì)胞遷移能力及酶活性檢測(cè)表明SIRNA抑制和過表達(dá)INNVIT基因?qū)?xì)胞遷移力及2金屬蛋白酶MMP9和MMP的表達(dá)沒有影響。推測(cè)INNVIT基因的抑制主要通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯而降低黑素細(xì)胞的存活和增殖能力。最后研究了INNVIT基因?qū)谒丶?xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹與酪氨酸酶的相關(guān)性。掃描電鏡觀察表明SIRNA抑制的黑素細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有明顯的膨脹擴(kuò)大現(xiàn)象其酪氨酸酶蛋白表達(dá)存在極顯著的增加。細(xì)胞免疫熒光共定位了酪氨酸酶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記鈣網(wǎng)蛋白發(fā)現(xiàn)抑制組細(xì)胞的酪氨酸酶大部分停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表明其酪氨酸酶的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出發(fā)生阻滯可見抑制INNVIT基因表達(dá)影響了黑素細(xì)胞的酪氨酸酶從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹從而導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)活性異常。以上研究表明本研究為INNVIT基因影響黑素細(xì)胞的增殖和凋亡能力提供了有力的證據(jù)并揭示了白癜風(fēng)黑素細(xì)胞酪氨酸酶的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能性輸出障礙的可能機(jī)制。

簡(jiǎn)介：博士學(xué)位論文專業(yè)學(xué)位學(xué)校代碼10023學(xué)號(hào)B2012003040肝細(xì)胞癌的早期臨床結(jié)局和遠(yuǎn)期預(yù)后相關(guān)分子生物學(xué)因素研究RESEARCHOFEARLYCLINICALOUTCOMEANDLONGTERMPROGNOSTICMOLECULARFACTORINHEPATOCEL1ULARCARCINOMA所院姓名指導(dǎo)教師導(dǎo)師小組學(xué)科專業(yè)研究方向完成日期中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院劉發(fā)強(qiáng)吳健雄教授林東昕教授、譚文教授腫瘤學(xué)肝臟腫瘤的外科治療二零一五年五月一令一血，牛血月北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士研究生學(xué)位論文圖索弓圖索引圖1研究技術(shù)路線圖14圖2健康狀況轉(zhuǎn)歸示意圖18圖3決策模型結(jié)構(gòu)示意圖19圖4決策模型分析路線圖21圖5術(shù)后指標(biāo)變化2328圖6住院天數(shù)和住院費(fèi)用2829圖7決策模型30圖8決策模型的回乘分析結(jié)果31圖9CEA曲線32圖10單因素敏感性分析的參數(shù)錄入33圖11單因素敏感性分析的TORNADO圖形分析結(jié)果35圖12EENPN組的術(shù)后有并發(fā)癥單因素敏感性分析的最大支付意愿36圖13按WHO的WTP繪制的成本一效果可接受曲線37圖14按本研究確定的WTP繪制的成本一效果可接受曲線38圖15按本研究與WHO的WTP之間的成本一效果可接受曲線39圖16EN保護(hù)肝臟、改善肝功能的作用機(jī)理41圖17EN縮短住院天數(shù)和降低住院費(fèi)用效應(yīng)42圖18RNA的分類56圖19MIRNA的生物合成過程與功能57圖20研究流程圖60圖21MIRNA相關(guān)SNP的文獻(xiàn)分析61圖22SEQUENOMSNP位點(diǎn)分型檢測(cè)法具體技術(shù)路線圖65圖23KAPLANMEIER生存曲線7072圖24KAPLANMEIER生存曲線SNP74圖25成熟MIRNAL95序列圖77圖26HASMIR195相關(guān)SNP位點(diǎn)圖78

簡(jiǎn)介：目的隨著人們生活水平的提高，工作節(jié)奏的加快，高血壓病成為了21世紀(jì)全球的常見病多發(fā)病。由于中國高血壓病患者發(fā)病率高，誤診率高，漏診率高，研究中國高血壓病患者的致病因素成為了診治高血壓病的重要目標(biāo)。薈萃研究指出，易患基因環(huán)境因素高血壓病。高血壓病靶器官損害是影響高血壓病預(yù)后的主要問題。其中，高血壓病患者并發(fā)左心室肥厚的比例約3050％。因此，研究高血壓病并發(fā)左心室肥厚的危險(xiǎn)因素對(duì)臨床診治高血壓病的意義重大。盡管近10年來，在高血壓病的遺傳學(xué)和環(huán)境因素研究方面取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，但是以往的研究多數(shù)將遺傳因素和環(huán)境因素孤立分析，與疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律不盡符合；將高脂血癥、動(dòng)脈硬化、糖尿病、代謝綜合征等疾病與高血壓病分開研究，妨礙高血壓病病因研究的突破；以核基因、高血壓家系為主要研究對(duì)象，忽略了有“能量工廠”美譽(yù)的線粒體作用，及散發(fā)的高血壓病人群特點(diǎn)。以歐洲白種人、非洲裔美國人、高加索人群為主要研究人群，對(duì)中國人群的相關(guān)研究甚少。本研究對(duì)990例居住于中國北京的漢族高血壓病患者臨床及線粒體熱點(diǎn)基因進(jìn)行分析研究，以期尋找高血壓病及其靶器官損害的遺傳學(xué)及臨床標(biāo)志，為臨床診治高血壓病提供一定的理論基礎(chǔ)及診治新靶點(diǎn)。方法本研究采取多學(xué)科聯(lián)合方法臨床工作者、遺傳學(xué)家、統(tǒng)計(jì)學(xué)家、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)及分子生物學(xué)專業(yè)人員組成課題組，與國外遺傳學(xué)機(jī)構(gòu)聯(lián)合，隨機(jī)選取2006年1月至2007年1月之間解放軍總醫(yī)院的門診、住院及干休所的高血壓病患者990例。對(duì)入選的高血壓病患者遺傳因素和環(huán)境因素進(jìn)行分析。抽取外周靜脈血提取線粒體DNA，完善血生化及血常規(guī)檢測(cè)，完善心臟超聲檢查。采用侯選基因策略及線粒體基因全序列掃描，選取線粒體熱點(diǎn)基因TRNALEUUUM，TRNIYS和TRNAILE，圍繞這3個(gè)熱點(diǎn)對(duì)高血壓病患者進(jìn)行線粒體篩查。此外，采用MALLOWS’CP模型對(duì)多變量進(jìn)行逐步線性回歸分析。自變量為收縮壓，舒張壓，左室肥厚指數(shù)。因變量包括環(huán)境因素和線粒體基因點(diǎn)突變。環(huán)境因素選擇臨床上可能影響高血壓病及左心室肥厚發(fā)生發(fā)展病程的主要因素如年齡、性別、心率、體表面積、家族史、發(fā)病年齡、冠心病、腦血管病、睡眠呼吸暫停綜合征、腎臟疾病、糖尿病、治療、飲酒、吸煙、空腹血糖水平、血尿酸及肌酐水平。線粒體基因點(diǎn)突變選擇發(fā)生錯(cuò)義突變和位于TRNA或RRNA上的突變，突變率≥3‰。所有統(tǒng)計(jì)分析采用STATA70統(tǒng)計(jì)軟件STATACP，COLLEGESTATION，TX和SAS91統(tǒng)計(jì)軟件SASINSTITIUTE，CAREY，NC。最后，將有意義的線粒體突變患者作為先證者，采集家系成員臨床資料，分子生物學(xué)資料及建立永生細(xì)胞系，進(jìn)行線粒體功能分析。結(jié)果1我們?cè)?例BJH1BJH7高血壓病患者TRNAILE基因上發(fā)現(xiàn)了線粒體點(diǎn)突變。BJH1的A4263G及BJH6的T4277C均為未報(bào)道過的新突變。BJH2的T4316INS，BJH3的A4317G和BJH4的A4295G為臨床報(bào)道的與人類疾病密切相關(guān)的點(diǎn)突變。通過24對(duì)引物對(duì)7例患者線粒體基因全序列掃描發(fā)現(xiàn)，除TRNAILE基因外，在編碼區(qū)和12SRNA基因上，7例患者存在6個(gè)共同的突變12SRNA基因上的A750G，A1438G；ND2基因上的A4769G，A6基因上的A8860G，ND4基因上的G11719A以及CYTB基因上的A15326G。2多元分析發(fā)現(xiàn)高血壓病患者的收縮壓與性別Β352±127，P001及線粒體基因T8603C突變?chǔ)?639±1039，P001顯著正相關(guān)Β352±127，P001，與線粒體A8343G突變?chǔ)?299±900，P001顯著負(fù)相關(guān)。舒張壓和心率Β013±003，P001，家族史Β180±078，P002顯著正相關(guān)；與性別Β034±003，P＜001，入選年齡Β034±003，P＜001，發(fā)病年齡Β008±003，P000，空腹血糖Β196±080，P001及A8343G點(diǎn)突變?chǔ)?631±544，P001呈負(fù)相關(guān)。3臨床、生化及遺傳學(xué)研究結(jié)果顯示一個(gè)三代的漢族高血壓病伴左心室肥厚家系遵循母系遺傳的原則。所有的母系成員Ⅱ1，Ⅱ4，Ⅱ5及Ⅲ2均含有線粒體A4401G突變，所有的父系成員Ⅰ1，Ⅱ2，Ⅲ3無此突變。270例正常對(duì)照組也無此突變。該突變?yōu)槲磮?bào)道過的新突變，且該突變位于于TRNA和TRNAGLN的結(jié)合部位。TRNAGLN水平下降了27114021％，TRNA下降了20223008％。此外，母系成員氧消耗量也較對(duì)照組顯著下降P00001。而有臨床癥狀的Ⅰ2氧消耗量比無癥狀的母系成員Ⅱ1和Ⅲ2下降尤其多P00007。4多元分析發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素與LVMI相關(guān)。如冠心病Β733±206，P＜00001，性別Β1240±259，P＜00001，腎臟疾病Β583±241，P00006，體表面積Β1583±683，P00042，家族史Β501±215，P00038，發(fā)病年齡Β032±007，P00042，收縮壓Β023±006，P＜00001和舒張壓Β039±009，P00107。結(jié)論1線粒體TRNAILE基因突變?cè)谠l(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制中的作用不容忽視，可能成為臨床上診斷及治療原發(fā)性高血壓的新靶點(diǎn)，值得深入研究。2環(huán)境因素性別、年齡與家族史協(xié)同線粒體基因點(diǎn)突變A8343G和T8603C影響了高血壓病患者的血壓水平。3臨床、生化及遺傳學(xué)研究結(jié)果顯示線粒體非編碼區(qū)的A4401G突變可能參與了高血壓病左心室肥厚的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。4環(huán)境因素與線粒體突變相比，對(duì)高血壓病進(jìn)展為左心室肥厚發(fā)揮了更為重要的作用。5一些新發(fā)現(xiàn)的，位于線粒體基因特殊位置的突變有可能影響線粒體的功能，是高血壓病左心室肥厚的發(fā)病機(jī)制之一，值得進(jìn)一步研究。

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簡(jiǎn)介：呼吸道細(xì)菌感染是臨床常見病、多發(fā)病，隨著疾病譜的改變、治療新技術(shù)的運(yùn)用和經(jīng)驗(yàn)用藥，導(dǎo)致條件致病菌引起的呼吸道感染增多、細(xì)菌譜變化和對(duì)抗生素耐藥性不斷增高。肺炎克雷伯菌KLEBSIELLAPNEUMONIAE，KP是呼吸道感染和院內(nèi)感染的常見致病菌，近年來，隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用，產(chǎn)生了對(duì)美羅培南或亞胺培南耐藥的腸桿菌。而肺炎克雷伯菌一旦產(chǎn)生碳青酶烯酶KLEBSIELLAPNEUMONIAECARBAPENEMASE，KPC幾乎可以對(duì)所有Β內(nèi)酰胺酶類抗生素產(chǎn)生耐藥作用。本課題對(duì)上海市某肺部?？漆t(yī)院呼吸道感染細(xì)菌譜、耐藥譜和臨床特征進(jìn)行調(diào)查，著重了解克雷伯菌感染所致肺炎的流行現(xiàn)狀、抗生素耐藥情況及分子生物學(xué)特征，探索KPC耐藥菌傳播的危險(xiǎn)因素和分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床進(jìn)一步有效控制KPC耐藥菌傳播提供科學(xué)依據(jù)。本研究共分為以下三個(gè)部分第一部分住院患者呼吸道細(xì)菌感染流行病學(xué)研究目的調(diào)查上海市某肺部?？漆t(yī)院住院患者呼吸道細(xì)菌感染譜、臨床特點(diǎn)、耐藥情況及可疑危險(xiǎn)因素分布，為有效控制住院患者呼吸道細(xì)菌感染提供依據(jù)。方法以連續(xù)三個(gè)月內(nèi)入住該院呼吸內(nèi)科和胸外科的因疑似呼吸道感染而送檢痰普培標(biāo)本的病人為研究對(duì)象開展橫斷面調(diào)查，通過細(xì)菌培養(yǎng)、耐藥檢測(cè)、病史記錄查詢和問卷調(diào)查等方式，了解住院患者呼吸道細(xì)菌性感染陽性率、細(xì)菌譜和耐藥分布，分析影響住院患者發(fā)生呼吸道細(xì)菌感染的主要危險(xiǎn)因素。結(jié)果研究共識(shí)別合格對(duì)象1865例，其中完成痰標(biāo)本收集的患者為1290例，從中分離到呼吸道感染細(xì)菌菌株249株，細(xì)菌感染陽性率為1930％?；颊吆粑兰?xì)菌感染的分布依次為肺炎克雷伯菌137例550％，銅綠假單伯菌30例120％，鮑曼不動(dòng)菌30例120％，陰溝腸桿菌15例60％，大腸埃希菌8例32％和金黃色葡萄球菌1例，此外還有其它細(xì)菌感染28例112％。249例感染患者中科室分布情況，結(jié)核科29例96％、塵肺科31例188％、呼吸科21例70％、腫瘤科65例148％、胸外科監(jiān)護(hù)室101例153％，各科室的致病菌感染存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（X270347，P0000），在各科室中，塵肺科的檢出率最高，其次是胸外科和腫瘤科致病菌感染年齡分布情況，＜40歲21例82％、40～歲26例103％、50～歲72例133％、60～歲67例128％，≧70歲61例216％，各年齡段致病菌檢出率存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異X217634，P0001，隨年齡的增長(zhǎng)而提高，≧70歲的老年病人最高不同就業(yè)狀態(tài)致病菌分布情況退休陽性172例229％、在職68例144％、待業(yè)4例82％，不同就業(yè)狀態(tài)的對(duì)象致病菌感染構(gòu)成比不同，退休的患者感染高于在職和待業(yè)的患者X218060，P0000男性178例145％，女性69例108％男性與女性致病菌感染未見統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異X22784，P0095測(cè)定249株細(xì)菌對(duì)16種抗菌藥物的敏感性，130株肺炎克雷伯氏菌敏感性＞80％的為氨芐西林舒巴坦869％、阿米卡星934％、氨曲南898％、環(huán)丙沙星927％、頭孢曲松891％、頭孢唑林839％、厄他培南934％、頭孢匹美891％、慶大霉素912％、亞胺培南920％、左氧氟沙星920％、復(fù)方新諾明854％、頭孢他啶883％、妥布霉素920％，耐藥率＞80％的為氨芐西林905％30株銅綠假單胞菌敏感性＞80％的為阿米卡星100％、氨曲南100％、環(huán)丙沙星967％、頭孢匹美967％、慶大霉素100％、亞胺培南933％、左氧氟沙星90％、頭孢他啶100％、妥布霉素100％，耐藥率＞80％的為氨芐西林100％、氨芐西林舒巴坦100％、頭孢唑林967％、呋喃妥因100％、復(fù)方新諾明100％，30株孢曼不動(dòng)菌敏感性＞80％的為氨芐西林舒巴坦867％、阿米卡星967％、環(huán)丙沙星833％、頭孢匹美867％、慶大霉素833％、亞胺培南867％、左氧氟沙星867％、復(fù)方新諾明80％、頭孢他啶867％、妥布霉素90％，耐藥率＞80％的為氨芐西林967％、頭孢曲松967％、頭孢唑林967％、呋喃妥因967％。進(jìn)一步分析呼吸道細(xì)菌感染病例的臨床特征，患者在入院前抗生素的使用情況不同性別之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異X24934，P0294不同年齡組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異X226734，P0045，其中50～歲使用1種和≧3種抗生素最多，分別為378％和389％、60～歲使用2種抗生素最多占298％不同病區(qū)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（X230776，P0000），使用1種抗生素依次為呼吸科316％、腫瘤科276％、胸外科ICU214％、結(jié)核科194％、塵肺科0，使用2種抗生素依次為呼吸科519％、結(jié)核科192％腫瘤科154％、胸外科ICU135％、塵肺科0，使用≧3種抗生素依次為呼吸科389％、結(jié)核科292％腫瘤科264％、胸外科ICU56％、塵肺科0，抗生素使用呼吸科最高，塵肺科均沒用影響住院病人肺部細(xì)菌性感染相關(guān)的危險(xiǎn)因素，單因素分析各年齡段細(xì)菌性感染有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義X217634，P0001依次為50～歲291％、60～歲271％、≧70歲247％、40～歲105％、＜40歲85％性別和入院前住院次數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異住院前臨床特征分析有肺葉切除史、氣管鏡操作史、肺穿刺史、激素使用史、胸腔插管史、放化療史和糖尿病史對(duì)細(xì)菌感染均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異入院后肺部手術(shù)X26259，P0012、氣管鏡檢查X26707，P0010、呼吸機(jī)使用（X28537，P0003）對(duì)呼吸道感染有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，氣管插管、胸腔插管和肺穿刺無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。結(jié)論上海市某肺部?？漆t(yī)院住院患者送檢痰標(biāo)本細(xì)菌檢出陽性率1930％，其中革蘭氏陰性菌檢出率＞80％，高于文獻(xiàn)報(bào)道。249例感染患者塵肺科的檢出率最高，呼吸科最低。130株肺炎克雷伯氏菌對(duì)大多數(shù)抗菌藥物敏感，對(duì)氨芐西林耐藥率為905％30株銅綠假單胞菌對(duì)多數(shù)抗菌藥物敏感，對(duì)氨芐西林、氨芐西林舒巴坦、頭孢唑林均完全耐藥30株孢曼不動(dòng)菌對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑林耐藥。所以，在經(jīng)驗(yàn)性使用抗菌藥物時(shí)，應(yīng)盡量避免使用以上耐藥率較高的抗生素。不同病區(qū)使用抗生素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呼吸科最高，塵肺科均沒用，結(jié)合致病菌的感染情況，早期合理使用抗生素對(duì)控制細(xì)菌感染有幫助。入院后肺部手術(shù)、氣管鏡檢查、呼吸機(jī)使用對(duì)呼吸道感染有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明入院后的侵入性操作和治療容易引起呼吸道感染，所以應(yīng)做好設(shè)備的消毒和滅菌。氣管插管、胸腔插管和肺穿刺無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示應(yīng)盡可能使用一次性的醫(yī)療器械，可以避免人群間的交叉感染。第二部分肺炎克雷伯氏菌耐藥相關(guān)基因特征研究目的研究上海市某肺部?？漆t(yī)院肺炎克雷伯氏菌抗生素的易感性和由廣譜Β內(nèi)酰胺酶ESBLS和AMPC酶質(zhì)粒介導(dǎo)的基因分型。方法連續(xù)三個(gè)月從檢驗(yàn)科收集的211例肺炎克雷伯氏菌陽性標(biāo)本。通過微掃描MIC方法檢測(cè)細(xì)菌抗生素的敏感性，用PCR擴(kuò)增與DNA純化分離對(duì)ESBLS和AMPC酶作表型鑒定。結(jié)果在所研究的211株肺炎克雷伯氏菌中，經(jīng)表型試驗(yàn)確認(rèn)有78株產(chǎn)ESBLS，產(chǎn)ESBLS菌對(duì)氨芐西林全部耐藥，而非產(chǎn)ESBLS菌對(duì)氨芐西林耐藥率為774％，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P00001。產(chǎn)ESBLS菌對(duì)氨曲南和頭孢他啶的耐藥率分別為205％和154％，與非產(chǎn)ESBLS菌（08％和15％）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005。產(chǎn)AMPC酶菌株對(duì)頭孢他啶、氨曲南、環(huán)丙沙星和阿米卡星敏感性明顯降低（P＜005）。CTXM型超廣譜Β內(nèi)酰胺酶陽性菌株基因型均為CTXM3。比較不同ESBLS耐藥相關(guān)基因型對(duì)抗生素的耐藥率。所有SHV陽性菌株對(duì)氨芐西林耐藥，明顯高于SHV陰性菌株，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義100％VS75％，X22652，P00001。TEM陽性菌株對(duì)頭孢他啶的耐藥率要明顯高TEM陰性菌株103％VS24％，X2419，P0041，CTX陽性菌株對(duì)頭孢他啶135％VS40％，X2512，P0024和氨曲南162％VS46％，X2665，P0001耐藥率要高于CTX陰性菌株，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論本地區(qū)肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)ESBLS狀況已很嚴(yán)重。研究顯示該院臨床分離的肺炎克雷伯菌主要存在SHV1型和TEM型ESBLS流行。通過檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌ESBLS基因和產(chǎn)ESBLS酶，以及AMPC基因和產(chǎn)AMPC酶，可為臨床醫(yī)師的合理用藥提供一定指導(dǎo)。第三部分肺炎克雷伯氏菌基因分型及流行特征研究目的研究上海市某肺部專科醫(yī)院住院患者呼吸道肺炎克雷伯氏菌基因分型及與臨床耐藥的關(guān)系。方法通過抗生素敏感試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增、MLST分析網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。結(jié)果對(duì)211株KP菌株進(jìn)行MLST分析，有94種不同的序列型。通過EBURST分析，發(fā)現(xiàn)所識(shí)別的60種ST型可以進(jìn)一步組成三種主要的克隆系CLONALCOMPLEX和10種單一型SINGLETONS。分析不同克隆系對(duì)抗生素藥物的敏感情況結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除CC259克隆系外，其他克隆系及獨(dú)株普遍對(duì)氨芐西林有較高的耐藥比例，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無明顯差異。CC5021克隆和CC340克隆對(duì)頭孢他啶耐藥率分別為111％和10％，明顯高于其他克隆系菌株和獨(dú)株，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005。所有克隆系和獨(dú)株對(duì)氨曲南的耐藥率在10％左右。另外，CC340克隆系對(duì)于環(huán)丙沙星和阿米卡星的耐藥率分別為133％和167％，明顯高于其他克隆系菌株和獨(dú)株P(guān)＜005。進(jìn)一步分析不同克隆系中耐藥相關(guān)基因分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同克隆系中SHV1型基因陽性的比例相當(dāng)，在397％～421％不等，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CC5021和CC340克隆系中TEM、CTXM型基因陽性比例分別為741％和70％，且明顯高于其他克隆系菌株和獨(dú)株P(guān)＜005。通過單因素和多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主要流行菌株感染患者中更有可能是來自呼吸科25％VS15％，12595％CI1018～3624。同時(shí)感染主要流行菌株患者的住院天數(shù)要明顯高于感染其他菌株的患者10395％CI1020～2340。同時(shí)肺部感染是送檢主要流行菌株最主要的原因16795％CI1118～4578。結(jié)論本院流行的KP菌株與全球流行菌株有一定的遺傳相關(guān)性。醫(yī)院及周圍的地區(qū)存在某些KP克隆系的地方性流行。ST258型被認(rèn)為是引起碳青霉烯酶耐藥全球流行的主要菌群。對(duì)于感染ST11序列型KP株的患者即使識(shí)別和治療有助于更好地控制抑制碳青霉烯類藥物耐藥菌株在人群間的流行。BLACTXMBLATEM陽性KP菌對(duì)于頭孢菌素類抗生素耐藥性較高，主要流行株具有較強(qiáng)的傳播力，但毒力與其他菌株相當(dāng)。有必要在臨床和治療過程中監(jiān)測(cè)這些主要流行菌株及耐藥決定因素。

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