簡介：分類號(hào)論文題目密級(jí)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文英文題目導(dǎo)專論文提交日期20116學(xué)位授予日期20116墮J_I止一退墮半世需五HR一里刪詈一墮型盟型丘業(yè)叢盟監(jiān)BC一一盟衛(wèi)業(yè)UE一℃一型巫生。一T一墮致謝光陰似箭，歲月如梭，轉(zhuǎn)眼間三年時(shí)光如過眼煙云般匆匆飄過，站在畢業(yè)的門檻上，回想起幾年來的點(diǎn)點(diǎn)滴滴，我思緒萬千，感慨萬分。本論文是在導(dǎo)師夏平安教授和崔保安教授的悉心指導(dǎo)下完成的。兩位導(dǎo)師淵博的知識(shí)、精益求精的治學(xué)作風(fēng)、誨人不倦的高尚師德，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度和高度的敬業(yè)精神深深地感染和激勵(lì)著我。從論文選題、試驗(yàn)設(shè)計(jì)到論文的順利完成，無不蘊(yùn)含著導(dǎo)師的心血。值此論文完成之際，謹(jǐn)向尊敬的兩位導(dǎo)師致以最崇高的敬意和最衷心的感謝感謝導(dǎo)師組張改平院士、王川慶教授、寧長申教授、張龍現(xiàn)教授、許蘭菊教授、宋長緒研究員、李文剛教授、王亞賓副教授、陳麗穎副教授、張紅英副教授、陳紅英副教授、李新生副教授、魏戰(zhàn)勇副教授、王彥彬副教授、楊明凡老師、胡慧老師和金鉞老師在試驗(yàn)操作過程中給予我的熱情幫助和耐心指導(dǎo)，以及論文寫作中給予的建議和指導(dǎo)，使我的試驗(yàn)進(jìn)展和論文寫作得以順利完成。向哺育和培養(yǎng)我的母校和傳授我知識(shí)的全體老師致以崇高的敬意感謝研究生處、院黨總支的領(lǐng)導(dǎo)和老師三年來對(duì)我的關(guān)心和幫助感謝三年來一直給予我?guī)椭?、相互學(xué)習(xí)、共同進(jìn)步的研究生張志遠(yuǎn)、段二珍、盧曉艷和牧醫(yī)工程學(xué)院2008級(jí)全體碩士研究生。感謝師兄劉玉松、徐紅運(yùn)、范旭；師姐趙琳，張風(fēng)華；同屆研究生王睿、鮑登克、王淑娟、高東生；師妹張宜娜、谷素美；師弟周永輝、張繼希、張祥、慕春龍、楊青原、李曉博對(duì)試驗(yàn)的順利進(jìn)行提供的無私幫助最后，特別感謝養(yǎng)育我長大含辛茹苦的父母，感謝各位親朋好友對(duì)我無私的關(guān)愛和幫助，才使我的學(xué)業(yè)順利完成衷心感謝所有幫助和關(guān)心我的朋友們

簡介：廈門大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考其他個(gè)人或集體己經(jīng)發(fā)表的研究成果，均在文中以適當(dāng)方式明確標(biāo)明，并符合法律規(guī)范和廈門大學(xué)研究生學(xué)術(shù)活動(dòng)規(guī)范試行。另外，該學(xué)位論文為課題組的研究成果，獲得課題組經(jīng)費(fèi)或?qū)嶒?yàn)室的資助，在實(shí)驗(yàn)室完成。請(qǐng)?jiān)谝陨侠ㄌ?hào)內(nèi)填寫課題或課題組負(fù)責(zé)人或?qū)嶒?yàn)室名稱，未有此項(xiàng)聲明內(nèi)容的，可以不作特別聲明。聲明人C簽觸圣≥雹∽／‘誶弓月羅日L摘要摘要皮質(zhì)鑒定問題是當(dāng)前鞋服及制革質(zhì)量檢驗(yàn)行業(yè)亟待解決的技術(shù)問題。本課題采用傅里葉變換顯微紅外光譜法MICROFTIR對(duì)各類天然皮革、人造革材料進(jìn)行顯微圖像及紅外光譜分析。并在此基礎(chǔ)上使用分子生物學(xué)技術(shù)，以典型皮革材料牛、豬、山羊皮革為例，對(duì)皮革中的DNA進(jìn)行優(yōu)化提取，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增并DNA序列測定的方法進(jìn)行鑒定。首先使用MICROFTIR對(duì)天然皮革、再生皮革和人造革等鞋服用革類材料進(jìn)行分析，考察了樣品的顯微可見圖像及各部位的紅外光譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然皮革中的全粒面頭層皮革、修飾面頭層皮革、干法移膜剖層皮革、濕法移膜剖層皮革、絨面剖層皮革，再生革和人造革中的聚氨酯合成革、聚氯乙烯人造革具有明顯差異的顯微紅外光譜特征，根據(jù)顯微紅外光譜特征譜圖可以對(duì)以上材料進(jìn)行分類鑒別，并總結(jié)出這幾類革類材料的顯微紅外光譜特征。其次利用分子生物技術(shù)，通過提取牛、豬、山羊皮革中殘留的DNA，選擇合適引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出線粒體CYTB基因中的目標(biāo)DNA片段，通過序列測定進(jìn)行動(dòng)物種類判斷。經(jīng)過試驗(yàn)，由于影響PCR成功擴(kuò)增的因素較多，導(dǎo)致存在較高的假陰性判斷的風(fēng)險(xiǎn)，但通過典型皮革材料PCR擴(kuò)增并測序，陽性判斷的準(zhǔn)確率高。而且選擇合適引物，確定合適長度的擴(kuò)增靶序列、純化DNA模板、NESTEDPCR技術(shù)均有利于提高PCR擴(kuò)增成功的機(jī)會(huì)。本實(shí)驗(yàn)采用巢式通用引物對(duì)，擴(kuò)增長度約220BP的CYTB基因片段，通過測序比對(duì)能夠準(zhǔn)確鑒定上述幾種天然皮革材料?；谘芯拷Y(jié)果，總結(jié)了傅里葉變換顯微紅外光譜法鑒定各類皮革的方法要點(diǎn)，驗(yàn)證PCR擴(kuò)增測序鑒定動(dòng)物皮革種類的可行性，運(yùn)用巢式PCR等措施提高了擴(kuò)增成功率，并提出存在的問題和今后工作的方向，為最終解決皮質(zhì)鑒定問題打下基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞顯微紅外光譜法；PCR擴(kuò)增；皮革鑒定

簡介：海參是我國傳統(tǒng)的海洋食物和藥物資源。近年來，隨著對(duì)海參研究的不斷深入，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)海參具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、促進(jìn)造血功能、抗凝血和降血脂等多種生理功效，海參及海參產(chǎn)品也因此得到越來越多的關(guān)注。海參膠囊、即食海參、海參口服液等產(chǎn)品的出現(xiàn)，豐富了海參產(chǎn)品的種類，進(jìn)一步提升了海參的價(jià)值。傳統(tǒng)的海參鑒定方法主要依據(jù)海參的外部形態(tài)和解剖特征，但這種方法不適用于加工后的海參的種類鑒定。因此建立快速、簡便的海參種類鑒定方法，對(duì)于規(guī)范海參市場、保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益至關(guān)重要，對(duì)加快海參產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展具有重要的意義。隨著DNA條形碼概念的提出，基于DNA條形碼的分子生物學(xué)技術(shù)取得了快速發(fā)展，在種類鑒定領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。本論文研究了海參線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基ⅠMITOCHONDRIALCYTOCHROMECOXIDASESUBUNITⅠ，COⅠ基因作為DNA條形碼用于海參種類鑒定的可行性。利用DNASTAR61、DNAMAN60和MEGA41軟件對(duì)海參線粒體COⅠ基因序列進(jìn)行分析，計(jì)算不同海參的堿基組成，海參的種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離，分別利用鄰接法和最大簡約法構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹。結(jié)果表明海參的種間遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離，同種海參不同個(gè)體在系統(tǒng)樹中分別形成各自獨(dú)立的分支，表明以COⅠ基因作為海參DNA條形碼進(jìn)行種類鑒定具有一定的可行性。在DNA條形碼的基礎(chǔ)上，建立了斑點(diǎn)雜交方法用于四種常見經(jīng)濟(jì)海參種類的鑒定。首先利用DNASTAR61對(duì)加州擬刺參PARASTICHOPUSCALIFNICUS，北大西洋瓜參CUCUMARIAFRONDOSA，仿刺參APOSTICHOPUSJAPONICAS及梅花參THELENOTAANANAS四種海參的線粒體COⅠ基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，然后采用PRIMERPREMIER50軟件設(shè)計(jì)四種海參的特異性探針，用于斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的四條探針具有高度的特異性，靈敏度可達(dá)100NG，能夠?qū)崿F(xiàn)四種海參的準(zhǔn)確鑒定。根據(jù)對(duì)四種海參線粒體COⅠ基因的比對(duì)結(jié)果，采用PRIMERPREMIER50設(shè)計(jì)合成了四組特異性引物，建立了多重PCR方法用于四種海參種類的鑒定。仿刺參、梅花參、加州擬刺參和北大西洋瓜參的擴(kuò)增片段長度分別為212BP、301BP、261BP和358BP，能夠通過電泳得到區(qū)分。對(duì)多重PCR的特異性和靈敏度進(jìn)行研究，結(jié)果表明，四組引物具有高度的特異性，靈敏度達(dá)到NG級(jí)；對(duì)不同海參的混合樣品進(jìn)行多重PCR鑒定，結(jié)果顯示該方法能夠同時(shí)檢測混合樣品中的所有海參種類。表明多重PCR方法是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的海參種類鑒定方法。采用DNAMAN60對(duì)加州擬刺參PARASTICHOPUSCALIFNICUS，北大西洋瓜參CUCUMARIAFRONDOSA，仿刺參APOSTICHOPUSJAPONICAS，梅花參THELENOTAANANAS及輻肛參ACTINOPYGALECANA線粒體COⅠ基因進(jìn)行分析，建立酶切圖譜，選擇BAMHⅠ，KPNⅠ，PSTⅠ，XBAⅠ，ECO31Ⅰ用于五種海參的PCRRFLP的分析。采用限制性內(nèi)切酶對(duì)五種海參線粒體COⅠ基因進(jìn)行酶切，酶切結(jié)果與分析結(jié)果吻合，沒有非特異性酶切條帶的出現(xiàn)。對(duì)不同海參的混合樣品進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，本研究建立的PCRRFLP方法能同時(shí)鑒定兩種海參。說明建立的PCRRFLP是一種簡單、快速、可靠的海參種類鑒定方法。分別采用斑點(diǎn)雜交、多重PCR、PCRRFLP方法對(duì)四種海參的不同加工樣品進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，本論文建立的三種方法中，多重PCR鑒定的準(zhǔn)確率最高，達(dá)到了100％，PCRRFLP方法其次，為875％，斑點(diǎn)雜交方法為75％。綜上所述，本論文建立了三種分子生物學(xué)方法，可以用于海參種類的快速、準(zhǔn)確鑒定，三種方法的建立，為構(gòu)建海參鑒定體系，實(shí)現(xiàn)海參產(chǎn)品的種類鑒定，規(guī)范海參市場秩序，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益具有重要的意義。

簡介：，中圖分類號(hào)UDC學(xué)校代碼10055密級(jí)公開蠱恐犬淫碩士學(xué)位論文GEOBACILLUSTHERMODENITRILTCANSNG802學(xué)科專業(yè)生物絲堂皇盆王生物堂研究方向蛋自廈王捏改造南開大學(xué)研究生院二。一一年五月南開大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的研究成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本學(xué)位論文的研究成果不包含任何他人創(chuàng)作的、已公開發(fā)表或者沒有公開發(fā)表的作品的內(nèi)容。對(duì)本論文所涉及的研究工作做出貢獻(xiàn)的其他個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名閨江2011年5月25ET非公開學(xué)位論文標(biāo)注說明根據(jù)南開大學(xué)有關(guān)規(guī)定，非公開學(xué)位論文須經(jīng)指導(dǎo)教師同意、作者本人申請(qǐng)和相關(guān)部門批準(zhǔn)方能標(biāo)注。未經(jīng)批準(zhǔn)的均為公開學(xué)位論文，公開學(xué)位論文本說明為空白。論文題目申請(qǐng)密級(jí)口限制≤2年口秘密≤10年口機(jī)密≤20年保密期限20審批表編號(hào)年月日至20年月日批準(zhǔn)日期20年月日限制★2年最長2年，可少于2年秘密★L(fēng)O年最長5年，可少于5年機(jī)密★20年最長10年，可少于10年

簡介：太原理工大學(xué)碩士學(xué)位論文ITRANSLATIONREPTONEXCERPTSOFATEXTBOOKFHIGHEREDUCATIONCELLMOLECULARBIOLOGYCONCEPTSEXPERIMENTS7THEDITIONABSTRACTBOOMINGBIOLOGICALSCIENCETECHNOLOGYIN21STCENTURYBOOSTSTHEDEVELOPMENTOFFOODPRODUCTIONMEDICALCAREMANYENGINEERINGDOMAINSLEADINGTOENMOUSEFFTSINTHECULTIVATIONOFBIOLOGICALTALENTSINBOTHBASICAPPLIEDRESEARCHITHASCREATEDAGREATDEMOFTRANSLATEDBIOLOGICALTEXTBOOKSTHROUGHREADINGTRANSLATEDTEXTBOOKSSTUDENTSGAINACOMPREHENSIVEPICTUREABOUTBIOLOGYACQUIREACCURATEPROFESSIONALKNOWLEDGETHELATESTPROGRESSOFTHISDISCIPLINEAREALSOPRESENTEDINTRODUCEDINTHESETEXTBOOKSTHEREPTISBASEDONTRANSLATIONPRACTICEOFCELLMOLECULARBIOLOGYCONCEPTSEXPERIMENTS7THEDITIONBYGERALDKARPFROMTHEIGINALBOOKSEVENTEENSECTIONSOFHUMANPERSPECTIVEARECOLLECTEDTHELENGTHOFWHICHISOVER100000INTOTALFMINGACOLLECTIONCELLMOLECULARBIOLOGYUNDERHUMANPERSPECTIVEBIOLOGICALTEXTBOOKSPRESENTFEATURESOFENGLISHFSCIENCETECHNOLOGYESTCONCERNINGBIOLOGYASWELLASTHATOFTEXTBOOKACCDINGTOVERMEERTHEPURPOSEOFTRANSLATIONDETERMINESTHESTRATEGIESWHICHINTHISPROJECTMEANSTHATTRANSLATIONSHOULDFULFILLTHEGOALOFESTTEXTACCURATECONCISEDELIVERYOFKNOWLEDGETHATOFTEXTBOOKSREADABLEACCURATEINSTRUCTIONACCDINGTOAIMSOFTHESOURCETEXTTRANSLATIONSTRATEGIESHAVEBEENANALYZEDFROMTHREEDIMENSIONSTERMINOLOGYSENTENCETEXTOFFIGUREILLUSTRATIONINTHISPAPERTHEAUTHPROPOSESSOLUTIONSFFIGURINGOUTTHEPRECISEMEANINGSOFTHREETYPESOFTERMINOLOGYDIFFICULTTOTRANSLATETHEAUTHALSOOFFERSSTRATEGIESTODEALWITHDEFINITIONSENTENCESNOMINALIZEDSTRUCTURESPASSIVESENTENCESWHICHARECONDUCIVETOREPRODUCETHEUNDERLYINGLOGICOFSENTENCESPRESENTMEANINGSWITHREADERACCEPTABLEEXPRESSIONSMEANWHILEMETHODOLOGIESTOTRANSLATEDEIONPROCESSINFIGUREILLUSTRATIONAREPRESENTEDINTHEPAPERBY

簡介：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中國狂犬病毒P和M基因分子生物學(xué)特征研究姓名王曉光申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師侯勇躍唐青20080501RESEARCHONCHARACTEROFMOLECULARBIOLOGYOFRABIESVIRUSPMGENESINCHINAABSTRACTALTHOUGHTHEBULKOFDATAANDRESEARCHONRVNOWEXISTINTHEPUBLICARCHIVES，THERELATIVELYFEWRESEARCHABOUTTHECHARACTERISTICSOFBOTHPHOSPHOPROTEINPPANDMATRIXPROTEINMPGENEOFRABIESVIRUSAREAVAILABLEINTHISSTUDYTHEDFAPOSITIVEHUMANANDDOGSAMPLESWERECOLLECTEDFROMSIXPROVINCESINCLUDINGGUANGXI，GUIZHOU，HUNAN，JIANGSU，ANHUIANDYUNNANTHENUCLEOTIDESEQUENCESOFTHEPPANDMPGENESWHICHWEREAMPLIFIEDBYRTPCRTECHNIQUESWEREDETERMINEDANDCOMPAREDWITHOTHERKNOWNRVISOLATESINGENBANKTHESIMILARITYFUNCTIONALSITESANDPHYLOGENETICANALYSESWEREPERFORMED，WHICHAREHELPFULTOTHEFURTHERRESEARCHONMOLECULARBIOLOGYANDSTRUCTUREOFRABIESVIRUSESINCHINATHERESULTSSHOWTHATTHESIMILARITYOFNUCLEOTIDEANDAMINOACIDSEQUENCESOFPPGENEARE818～100％AND8296997％RESPECTIVELYWHILETHOSEOFMPGENEARE887～100％AND950～1OO％RESPECTIVELYTHEHIGHLYCONSERVEDREGIONOFPGENEISTHEINTERACTIVEREGIONBETWEENPPANDENDOCHYLEMADYNEINLIGHT，CHAIN8LC8，ANDTHEFIRST19AMINOACIDSINTHEINTERACTIVEREGIONBETWEENPPANDLP1ARGEPROTEINTHEREISAFEWSUBSTITUTIONSITESINTHEPGENESUCHASTHESPECIFICSERPHOSPHORYLATIONSITESANDSOMESITESAMONGTHEINTERACTIVEREGIONAA209216BETWEENPPANDNPNUCLEOPROTEINTHEVARIABLEREGION’AA5075LOCATEDINTHESIGNALDOMAINTHEANALYSESOFMGENESHOWTHE58伽AMINOACIDRESIDUEANDTHEPPXYDOMAINAREHI曲LYCONSERVED，WHILET11E17也一22NDAMINOACIDRESIDUESARELOCATEDINTHEPOTENTIALANTIGENDETERMINANTINTHEENDOFNPACCORDINGTOTHEANALYSESOFPANDMGENE，ALLTHETESTEDRVISOLATESBELONGTABIESVIRUSGENOTYPE1BOTHPANDMGENEAREHIGHLYCONSERVEDANDTHEYTAKEONACOEVOLUTIONALPROPERTYALTHOUGHTHEDISTRIBUTIONOFCHINESEISOLATESISREGIONALLYITISNOTSTRICTLYCORRELATEDTOADMINISTRATIONALAREASTHERABIESVIRUSSTRAINSNOTONLYCIRCULATEDINTHEIRORIGINALPROVINCEBUTALSOSPREADTOTHEADJOININGPROVINCESAROUNDTHENATIONALBOUNDARYBETWEENCHINAANDSOUTHEASTASIANS，THERABIESVIRUSISOLATESARETIGHTLYRELATEDTOEACHOTHERGENETICALLYESPECIALLYBETWEENYUNNANPROVINCEANDTHAILANDALLTHERVSTRAINSISOLATEDFROMDOGANDHUMANSAMPLES，ANDPHYLOGENETIEANALYSESINDICATESTHETENDENCYOFRVEVOLUTIONISFROMDOGSTOHUMANS，WHICHCONFNMSTHEIMPORTANTROLEOFDOGRVINHUMANRABIES

簡介：密級(jí)論文編號(hào)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文重組傳染性支氣管炎病毒的生物學(xué)特性及CD59分子對(duì)其增殖的影響DEVELOPMENTANDCHARACTERIZATIONOFRECOMBINANTINFECTIOUSBRONCHITISVIRUSESANDTHEROLEOFCD59INIBVPROLIFERATION博士研究生魏衍全指導(dǎo)教師劉定祥研究員申請(qǐng)學(xué)位類別農(nóng)學(xué)博士業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)方向獸醫(yī)微生物及其分子生物學(xué)單位蘭州獸醫(yī)研究所研究生院2017年5月6Ⅲ2川Ⅲ7，川3㈣93川3ⅢY究養(yǎng)專研培獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所里交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其蝕人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果也不包舍為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)曲學(xué)位或證5而使用過的材料與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意研究生躲巍銹金掃‘，E6J7時(shí)問”J7年歲月日關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即T中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和凇允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描婷復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同摸體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容研究生簽名導(dǎo)師簽名繡金時(shí)間甲『7年；月彬厶勿時(shí)間∞L年N餾

簡介：克羅諾桿菌是一種腸桿菌科的食源性致病菌，其感染能夠?qū)е履X膜炎，小腸結(jié)腸炎和敗血癥，致死率為50％80％僥幸存活者依然會(huì)遭受終生的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥?？肆_諾桿菌主要感染人群為各個(gè)年齡階段的免疫力低下人群，尤其以低體重，出生不足月的新生兒為甚。目前通過流行病學(xué)的研究，已經(jīng)將新生兒感染與被污染的嬰幼兒配方奶粉聯(lián)系起來。因此2004年FAOWHO在日內(nèi)瓦的一次會(huì)議中將克羅諾桿菌和沙門氏菌列為嬰幼兒配方奶粉中存在的兩種A類致病菌。目前我國對(duì)于克羅諾桿菌的檢測主要依賴于常規(guī)的生理生化檢測方法，該方法步驟繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長，至少需要5天才能獲得結(jié)果。此外，這種檢測方法主要是對(duì)克羅諾桿菌屬的檢測，而本屬的菌株在自然界中的分布，致病性和毒力均存在著差異，阪崎克羅諾桿菌是分離出來的菌株中數(shù)量最多的，約占本屬的23，并且阪崎克羅諾桿菌CSAKAZAKIIST4在歐洲大陸的爆發(fā)案例中扮演了重要角色。因此有必要發(fā)展快速準(zhǔn)確的克羅諾桿菌乃至阪崎克羅諾桿菌檢測方法。本論文中，主要從以下幾個(gè)部分對(duì)克羅諾桿菌的快速檢測方法進(jìn)行了研究1抗克羅諾桿菌單鏈抗體SCFVH81的構(gòu)建及表達(dá)提取實(shí)驗(yàn)室保存的雜交瘤細(xì)胞RNA，并反轉(zhuǎn)錄為CDNA，使用通用引物組擴(kuò)增，并選擇符合大小的序列測序。通過IMGTVQUEST對(duì)這些序列進(jìn)行分析，最終選擇了符合開放閱讀框的H81和L11序列作為構(gòu)建單鏈抗體的重鏈和輕鏈基因。通過SOEPCR的方法將H81，L11和一個(gè)柔性LINKER連接起來構(gòu)建為單鏈抗體，并命名為SCFVH81。使用包涵體變性復(fù)性的方法制備單鏈抗體，其步驟簡單，過程極短，僅僅需要5天即可制備出大量的單鏈抗體。制備的單鏈抗體具有較好的特異性，其親和力常數(shù)為239±006106M1。2抗克羅諾桿菌單鏈抗體SCFVH81生物信息學(xué)分析通過IMGTVQUEST分析序列，分析單鏈抗體SCFVH81，分析其VDJ重排機(jī)制，及其胚性基因來源，劃分出單鏈抗體SCFVH81可變區(qū)和骨架區(qū)。使用PROTPARAMTOOL分析單鏈抗體SCFVH81，其等電點(diǎn)為705，因此選擇包涵體的復(fù)性液PH為80，有利于單鏈抗體的復(fù)性。使用SOPMA和ITASSAR預(yù)測單鏈抗體SCFVH81的二級(jí)結(jié)構(gòu)和3D模型，并進(jìn)行對(duì)接，找到了抗原抗體結(jié)合界面的關(guān)鍵氨基酸，這些關(guān)鍵氨基酸通常位于二級(jí)結(jié)構(gòu)的Β轉(zhuǎn)折附近。結(jié)合單鏈抗體3D模型空間結(jié)構(gòu)并錯(cuò)開其關(guān)鍵氨基酸引入二硫鍵，以減少對(duì)單鏈抗體SCFVH81活性的影響，但單鏈抗體SCFVH81特異性發(fā)生變化，這證明二硫鍵的引入還需要考慮其他因素的影響。3克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)的篩選及其PCR檢測方法的建立以阪崎克羅諾桿菌CSAKAZAKIIATCCBAA894基因組序列為模板，使用生物信息學(xué)對(duì)克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)進(jìn)行了篩選，共篩選出了22個(gè)特異性靶點(diǎn)，根據(jù)這些特異性靶點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，最終獲得了一對(duì)特異性引物N2。以該對(duì)引物為基礎(chǔ)建立具有較好的抗干擾能力的PCR檢測方法，其純茵培養(yǎng)物檢測限為102CFUML基因組DNA檢測限為128FGΜL。該檢測方法在人工污染實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過8H的培養(yǎng)，可以檢測出人工污染奶粉中接種量為35100CFU的克羅諾桿菌。4阪崎克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)的篩選及其PCR檢測方法的建立以阪崎克羅諾桿菌CSAKAZAKIIATCCBAA894基因組序列為模板，使用生物信息學(xué)工具，篩選出了38組阪崎克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)，以這些特異性靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，篩選出來了3對(duì)特異性引物（CS14，CS21和CS38）并建立了具有較好的抗干擾能力的PCR檢測方法，其基因組靈敏度分別為135PGΜL，135FGΜL，和135FGΜL其純菌培養(yǎng)物靈敏度為55105CFUML，55103CFUML，55103CFUML。經(jīng)過8H的預(yù)培養(yǎng)，引物對(duì)CS21和CS38在人工污染奶粉中的檢測限為55101CFU10G。5阪崎克羅諾桿菌種熒光定量PCR檢測方法的建立本研究以前一章篩選的特異性靶點(diǎn)和特異性引物CS38為基礎(chǔ)，建立了熒光定量PCR檢測方法，并以PMD19T上與特異性靶點(diǎn)相似性最小的序列構(gòu)建了擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)。該方法基因組DNA檢測靈敏度達(dá)到33FGΜL，純菌培養(yǎng)物檢測靈敏度達(dá)到47101CFUML。經(jīng)過6H增菌培養(yǎng)，該檢測方法能夠檢測到接種量為35100CFUML的嬰幼兒配方奶粉中的阪崎克羅諾桿菌。

簡介：目的腫瘤光學(xué)治療是目前臨床上繼外科手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療之外的新型治療手段。其治療原理是先給予對(duì)腫瘤組織有選擇性的光敏劑，然后使用特定波長的激光輻照腫瘤區(qū)域，從而使光敏劑高效地催化組織中的氧分子轉(zhuǎn)化為對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能有損害的活性氧物質(zhì)，或者使光敏劑吸收光能并轉(zhuǎn)化為局部高熱，最終實(shí)現(xiàn)治療腫瘤的目的。相對(duì)于腫瘤手術(shù)治療、化療、放療等目前臨床上采用的主要治療手段，腫瘤光學(xué)治療具有損傷部位小、選擇性高、安全性好等優(yōu)勢，可望在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。根據(jù)不同的作用原理，腫瘤光學(xué)治療主要分為光動(dòng)力學(xué)治療PDT和光熱治療PTT。無論是PDT或者PTT治療，決定它們療效的關(guān)鍵在于制備理想的光敏劑。理想的光敏劑至少應(yīng)同時(shí)具有兩種特性高效的光敏特性和良好的腫瘤選擇性。1為了提高光敏特性一方面，許多研究者分別將具有光熱作用的光敏劑與光動(dòng)力作用的光敏劑組裝或偶聯(lián)在一起，制備出了多種同時(shí)具有PDT和PTT治療效應(yīng)的納米材料類的光敏劑，大大提高了腫瘤光學(xué)治療的療效另一方面，由于生物組織對(duì)近紅外波段700900NM的光吸收較弱，因此選擇近紅外類的光敏劑可實(shí)現(xiàn)更深層組織的光學(xué)治療，顯著地推進(jìn)了光學(xué)治療的應(yīng)用前景。2為了增強(qiáng)光敏劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，最常采用的策略是通過化學(xué)方法將光敏劑與靶向配體進(jìn)行連接，使光敏劑能夠被腫瘤細(xì)胞膜上特異性表達(dá)的受體識(shí)別并高效地結(jié)合，從而賦予了光敏劑的靶向性。然而，納米材料類的光敏劑將面臨很多難題，比如難以大規(guī)模地制備、易被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織器官截留、潛在毒性等，導(dǎo)致大部分納米材料類的光敏劑還停留在早期開發(fā)階段。同時(shí)，基于化學(xué)連接策略開發(fā)靶向性光敏劑可能會(huì)改變靶向配體的結(jié)構(gòu)與功能、增加額外的合成步驟和成本，這些影響因素同樣會(huì)妨礙它們的實(shí)際應(yīng)用。鑒于目前常用光敏劑的以上不足，研發(fā)不依賴于納米高分子材料、也不需要復(fù)雜的化學(xué)連接，而是基于本身化學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)在的多功能特性的小分子類靶向光敏劑，可望避免上述問題，提高臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的潛力，推進(jìn)和擴(kuò)大腫瘤光學(xué)治療的前景。線粒體是細(xì)胞生存的重要細(xì)胞器，其在能源制造和細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮著核心作用。因此，線粒體一直被認(rèn)為是抗腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。尤其是最近研究表明，線粒體對(duì)過量的活性氧物質(zhì)及高熱非常敏感使得靶向腫瘤細(xì)胞線粒體的PDT、PTT療效非常顯著。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了一類具有腫瘤靶向性的吲哚七甲川花菁類近紅外熒光小分子。它們表現(xiàn)出不需要化學(xué)連接靶向配體，即能夠被多種腫瘤細(xì)胞選擇性攝取，同時(shí)蓄積于腫瘤細(xì)胞的線粒體中。某些花菁類近紅外熒光小分子化合物已經(jīng)被證明具有一定的光敏效應(yīng)。據(jù)此本研究設(shè)想以前期獲得的線粒體靶向染料分子為基礎(chǔ)，通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，可望制備合成同時(shí)具有靶向腫瘤細(xì)胞線粒體和整合PDT和PTT雙模態(tài)光學(xué)治療的吲哚七甲川花菁類近紅外熒光小分子光敏劑，顯著提高光學(xué)治療的療效。方法與結(jié)果根據(jù)前期的構(gòu)效關(guān)系研究及其它研究報(bào)道，親脂性陽離子特性的吲哚七甲川鏈?zhǔn)菍?duì)這類小分子的腫瘤細(xì)胞線粒體靶向特性起到至關(guān)重要作用的官能團(tuán)。同時(shí)，文獻(xiàn)報(bào)道花菁類小分子的光敏效應(yīng)與它們的脂水分布系數(shù)（LOGP）、極性、摩爾吸光系數(shù)等密切相關(guān)。因此，為了制備一種靶向腫瘤細(xì)胞線粒體，同時(shí)整合了PDT和PTT雙模態(tài)光學(xué)治療的小分子類光敏劑，本論文主要從以下三個(gè)方面開展研究，且主要結(jié)果如下一、腫瘤細(xì)胞線粒體靶向化學(xué)小分子類光敏劑的設(shè)計(jì)與合成在前期構(gòu)效關(guān)系研究基礎(chǔ)上，以吲哚七甲川鏈為線粒體靶向的母核結(jié)構(gòu)，通過改變吲哚環(huán)上的N烷基側(cè)鏈的鏈長（碳數(shù)N15）、改變側(cè)鏈末端的官能團(tuán)（以甲基、甲氧基、羧基、芳香基、羥基、磺酸基、氨基酸等進(jìn)行取代），合成了27個(gè)具有不同LOGP、極性以及摩爾吸光系數(shù)的新型吲哚七甲川花菁類近紅外熒光小分子，為獲得同時(shí)具有腫瘤細(xì)胞線粒體靶向、同步光熱和光動(dòng)力治療的多功能小分子提供了候選化合物。二、目標(biāo)光敏劑的篩選及體外多種腫瘤細(xì)胞中的光熱和光動(dòng)力作用研究從合成的27個(gè)代表性吲哚七甲川花菁類近紅外熒光小分子中，通過腫瘤靶向（腫瘤組織與肌肉組織的蓄積差別）、光熱特性（溶液升溫情況）、光動(dòng)力特性（單態(tài)氧、ROS生成水平），篩選獲得了具有顯著腫瘤靶向特性、光熱和光動(dòng)力作用的新型多功能小分子化合物7。進(jìn)一步在A549、H460、MCF7、4T1等多種腫瘤細(xì)胞株上驗(yàn)證了化合物7的光誘導(dǎo)殺傷作用通過冰浴處理或加入NAC（自由基清除劑）進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)化合物7具有光熱、光動(dòng)力協(xié)同的殺傷效應(yīng)通過將化合物7與兩種線粒體探針MITOTRACKER、RHO123進(jìn)行共染，確證了其線粒體靶向蓄積特性通過流式細(xì)胞分析和WESTERNBLOT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞線粒體途徑的細(xì)胞調(diào)亡可能是化合物7發(fā)揮光療效果的作用機(jī)制。三、體內(nèi)多種荷瘤動(dòng)物模型上驗(yàn)證目標(biāo)光敏劑7的光學(xué)治療作用化合物7的靶向光學(xué)治療腫瘤的效果依次在多種皮下移植瘤、原位移植瘤動(dòng)物模型上進(jìn)行了驗(yàn)證。通過近紅外熒光成像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在A549、4T1皮下及4T1原位移植瘤模型中均表現(xiàn)出良好的腫瘤選擇性蓄積特性向腫瘤部位給予808NM、08WCM2的激光照射作用5分鐘，然后分別通過紅外熱成像儀監(jiān)測腫瘤部位的溫度變化或檢測腫瘤組織中的ROS生成水平，在體內(nèi)模型中進(jìn)一步證實(shí)了化合物7的光熱、光動(dòng)力協(xié)同治療作用通過測量腫瘤體積、動(dòng)物體重變化情況及動(dòng)物的生存率，結(jié)果證實(shí)化合物7顯著地抑制了腫瘤的生長，在監(jiān)測期間動(dòng)物的生存率為100％并且沒有動(dòng)物出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)通過血常規(guī)、肝腎功能生化指標(biāo)的測量及主要臟器的病理切片觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，化合物7沒有引起明顯的毒副作用。另外，本研究還在基于臨床病人的腫瘤標(biāo)本建立的PDX動(dòng)物模型上確證了化合物7的優(yōu)秀的腫瘤光學(xué)治療療效，進(jìn)一步探索了其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的前景。結(jié)論本研究工作通過合理設(shè)計(jì)與化學(xué)合成，成功篩選獲得了同時(shí)具有腫瘤細(xì)胞線粒體靶向特性和PDT與PTT協(xié)同治療作用的多功能近紅外小分子化合物7。這種具有近紅外熒光成像功能的靶向光敏劑還能夠進(jìn)行腫瘤及腫瘤邊界光學(xué)顯像，為實(shí)現(xiàn)成像引導(dǎo)的精確光學(xué)治療提供了潛在的可能性。這是第一個(gè)以腫瘤細(xì)胞線粒體為治療靶點(diǎn)，同步實(shí)現(xiàn)腫瘤PDT和PTT協(xié)同治療的小分子光敏劑。該光敏劑具有良好的光敏特性，可望成為用于腫瘤光學(xué)治療的新型光敏劑，為腫瘤治療提供了潛在的新途徑。

簡介：熒光分子探針具有特異性、專一性、靈敏性、快速便捷以及可視化等優(yōu)點(diǎn)，近年來逐漸在環(huán)境監(jiān)測、生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域得到重視。尤其是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，人們對(duì)于應(yīng)用熒光探針來檢測細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化以及實(shí)現(xiàn)腫瘤的可視化診斷越來越有興趣。細(xì)胞內(nèi)或腫瘤內(nèi)環(huán)境具有特殊的性質(zhì)，如溶酶體的PH要比其他細(xì)胞內(nèi)囊泡的PH更低，腫瘤的PH比正常組織更低。利用這一性質(zhì)可以為腫瘤的早期診斷提供思路。本文總結(jié)了現(xiàn)有的研究成果，設(shè)計(jì)了新的酸敏感的熒光分子探針R6GEDA，基于該探針設(shè)計(jì)了一系列測定胞內(nèi)酸度的納米顆粒，并研究了酸敏感納米顆粒在腫瘤診斷中的應(yīng)用。一、基于羅丹明衍生物“開關(guān)環(huán)”機(jī)理的酸敏感探針R6GEDA設(shè)計(jì)了以羅丹明內(nèi)酰胺INTRALACTAM的“開關(guān)環(huán)”O(jiān)PENCLOSEDRING機(jī)理為基礎(chǔ)的酸敏感探針R6GEDA。該探針利用羅丹明這類熒光分子具有酸響應(yīng)的內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)“開關(guān)環(huán)”機(jī)理，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶酶體酸度的高靈敏響應(yīng)。該探針具有低背景，高亮度，抗淬滅，良好的生物兼容性，長時(shí)間保留等優(yōu)點(diǎn)，是一類有前景的溶酶體酸性探針，有希望在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用。二、基于羅丹明內(nèi)酰胺的雙色二氧化硅熒光納米顆粒設(shè)計(jì)了基于羅丹明內(nèi)酰胺為響應(yīng)發(fā)光團(tuán)，偶聯(lián)有高亮度的熒光分子熒光素FITC作為內(nèi)參，以二氧化硅為載體的雙色熒光納米顆粒，可以實(shí)現(xiàn)溶酶體內(nèi)酸度的高靈敏的比率測定。二氧化硅納米顆粒具有良好的生物兼容性，該熒光納米顆?？梢詫?shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酸度的測定，基于該探針我們用流式細(xì)胞儀的方法測定了在細(xì)胞凋亡APOTOSIS過程中細(xì)胞內(nèi)溶酶體酸度的變化。三、羅丹明偶聯(lián)丹磺酰氯的比率型熒光分子探針LYSODR設(shè)計(jì)了基于丹磺酰氯DANSYL共價(jià)偶聯(lián)酸敏感的羅丹明R6GEDA的比率型熒光小分子探針LYSODR，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡的PH精確測定。以丹磺酰氯為內(nèi)參，通過測定羅丹明發(fā)光團(tuán)對(duì)酸度的響應(yīng)，從而精確測定囊泡的酸度。該探針可以精確測定細(xì)胞內(nèi)單個(gè)溶酶體的酸度變化。利用該探針我們探索了HELA細(xì)胞和L929細(xì)胞的酸度差異，證實(shí)了腫瘤細(xì)胞酸性強(qiáng)于正常細(xì)胞的事實(shí)，并用于比較細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死時(shí)細(xì)胞酸度的差異，證明了細(xì)胞凋亡時(shí)PH要高于細(xì)胞壞死時(shí)，這是首次基于圖像法得到的比較凋亡和壞死這兩種重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究。四、偶聯(lián)有羅丹明內(nèi)酰胺的聚苯乙烯馬來酸酐高分子納米在腫瘤成像中的研究設(shè)計(jì)了偶聯(lián)有酸敏感的脫氧羅丹明內(nèi)酰胺（RHODAMINDEOXYLACTAM）的聚苯乙烯馬來酸酐高分子，實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)腫瘤組織的成像。我們發(fā)展了一個(gè)比之前工作報(bào)道的羅丹明內(nèi)酰胺R6GEDA更優(yōu)良的探針脫氧羅丹明內(nèi)酰胺RHODAMINDEOXYLACTAM，DRBEDA，該探針具有亮度更高，對(duì)酸更加敏感等優(yōu)點(diǎn)。將此探針偶聯(lián)在生物兼容性良好的聚苯乙烯馬來酸酐高分子上，利用生物體內(nèi)腫瘤血管的EPRENHANCEDPERMEABILITYRETENTION效應(yīng)，以及腫瘤細(xì)胞比正常組織更酸等特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的特異性聚集和低背景成像。該高分子具有特異性、低背景、良好的生物兼容性、較長的保留時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，有望在腫瘤成像中發(fā)揮作用。五、基于羅丹明脫氧內(nèi)酰胺檢測細(xì)胞表面的唾液酸細(xì)胞膜表面唾液酸具有多種生物學(xué)功能，如免疫、信號(hào)傳遞等，研究細(xì)胞膜表面的唾液酸一直是研究的熱點(diǎn)。設(shè)計(jì)了對(duì)醛基靈敏的脫氧內(nèi)酰胺羅丹明DRBEDA，可以有效監(jiān)測細(xì)胞表明的唾液酸。和傳統(tǒng)唾液酸監(jiān)測方法不同的是，DRBEDA只有在和醛基反應(yīng)后，脫氧內(nèi)酰胺的環(huán)打開才會(huì)有熒光，因而具有低背景、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

簡介：大鼠丘腦八眵蘑L，【|『J囚計(jì)學(xué)位論文表格插圖指導(dǎo)教師申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別專業(yè)名稱人體論文提交日期學(xué)位授予單位獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特另JJJD以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得大連醫(yī)科大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名司鹼鴦氧簽字日期業(yè)年』月型日

簡介：研究背景前交叉韌帶（ANTERICRUCIATELIGAMENTACL）損傷是青壯年尤其是競技體育運(yùn)動(dòng)者中最常見的膝關(guān)節(jié)韌帶損傷之一。臨床上以ACL重建術(shù)為其治療的主要方法。但ACL重建術(shù)并不能降低ACL損傷所繼發(fā)的創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎POSTTRAUMATICOSTEOARTHRITIS，PTOA發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)程。最新的研究表明，在關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后一周內(nèi)關(guān)節(jié)腔即出現(xiàn)大量的炎癥因子及氧自由基等，促使大量的軟骨細(xì)胞凋亡，成為啟動(dòng)PTOA關(guān)節(jié)軟骨退變和損傷的始動(dòng)因素。因此及早抑制這些炎性因子的活性對(duì)阻止或者減緩PTOA的發(fā)展至為關(guān)鍵。Α2巨球蛋白ALPHA2MACROGLOBULIN，A2M作為一種廣譜的蛋白酶抑制劑在關(guān)節(jié)軟骨損傷時(shí)被合成和分泌到關(guān)節(jié)液中，可有效地抑制IL1誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP3、9、13）和多種炎癥因子（IL1Β、6、8TNFA和GMCSF）的活性，但其在關(guān)節(jié)軟骨損傷后血清和關(guān)節(jié)液中分泌情況卻一直未見相關(guān)研究。本課題組在前期研究中也已經(jīng)證實(shí)采用前交叉韌帶切斷術(shù)（ANTERICRUCIATELIGAMENTTRANSECTION，ACLT）制作的SD大鼠的創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎PTOA模型中，適量的補(bǔ)充外源性的A2M可以明顯的減緩關(guān)節(jié)軟骨的退變進(jìn)程，具有非常顯著的正性關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用。但所使用的A2M為大分子量蛋白質(zhì)，免疫原性強(qiáng)，異種A2M長期關(guān)節(jié)腔注射極有可能引起免疫反應(yīng)，因此尋求一種更加簡單的提純或富含A2M血清的方法并觀察其對(duì)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎（PTOA）的治療效果具有非常重要臨床價(jià)值。研究目的1）分析A2M在ACL損傷時(shí)血清、關(guān)節(jié)液中的分布變化，明確與關(guān)節(jié)軟骨退化存在的關(guān)聯(lián)為外源性補(bǔ)充A2M提供理論依據(jù)；2）采用超濾離心法制備富含A2M血清（A2MRICHSERUM，A2MRS），檢測A2MRS中的A2M的蛋白濃度及蛋白活性，并分析其分子生物學(xué)特性；3）觀察富含A2M血清（A2MRICHSERUM，A2MRS）對(duì)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎（PTOA）的關(guān)節(jié)軟骨是否具有明顯的治療效果或減緩關(guān)節(jié)軟骨退化的作用。研究方法1）首先以2月齡96只SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分為兩組，每組48只。實(shí)驗(yàn)組通過前交叉韌帶切斷術(shù)（ANTERICRUCIATELIGAMENTTRANSECTION，ACLT）建立PTOA動(dòng)物模型，對(duì)照組采取假手術(shù)切開，不行ACLT。術(shù)后3天及1、2、4、8及12周每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組處死8只大鼠，收集血清及膝關(guān)節(jié)盥洗液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測大鼠ACL損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的關(guān)節(jié)盥洗液、血清中A2M的濃度變化規(guī)律，同時(shí)采用番紅O固綠染色觀察PTOA隨著時(shí)間的延長其關(guān)節(jié)軟骨退化的病理進(jìn)程與體液中A2M的含量變化是否存在某種關(guān)聯(lián)，探討A2M是否可以作為關(guān)節(jié)軟骨退變?cè)缙谠\斷及監(jiān)測病理進(jìn)程的生物標(biāo)記物為外源性補(bǔ)充A2M提供理論依據(jù)。2）采用超濾離心法制備富含A2M血清（A2MRICHSERUMA2MRS），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、蛋白免疫印跡法（WESTERNBLOT）等方法檢測其分子生物學(xué)性質(zhì)。3）選取80只健康成年SD大鼠分為4組，每組20只SHAMSALINE（空白對(duì)照組）、ACLTHA2MRS（高劑量組）、ACLTLA2MRS（低劑量組）、ACLTSALINE（陽性對(duì)照組）。手術(shù)后3天、2周、4周依據(jù)分組的不同關(guān)節(jié)腔定時(shí)注射30UL生理鹽水或30UL不同濃度A2MRS高劑量組A2M為20UGUL低劑量組A2M為10UGUL。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)治療后24小時(shí)關(guān)節(jié)腔注射MMP680免疫熒光探針，采用熒光分子斷層成像系統(tǒng)（FLUESCENCEMOLECULARTOMOGRAPHY，F(xiàn)MT）動(dòng)態(tài)檢測基質(zhì)金屬蛋白酶MATRIXMETALLOPROTEINASE，MMP）在關(guān)節(jié)液中濃度的變化，觀察A2MRS對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶是否具有抑制作用。術(shù)后8周統(tǒng)一處死動(dòng)物，小動(dòng)物X線片觀察膝關(guān)節(jié)退變的影像學(xué)表現(xiàn)，印度墨水染色評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨大體損傷情況，并行MANKIN’S評(píng)分；脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨采用甲苯胺藍(lán)、番紅O固綠染色、蘇木精伊紅染色（HE染色）和免疫組化法觀察A2MRS對(duì)PTOA軟骨病理退變是否具有減緩或者修復(fù)作用，采用OARIS評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨的病理變化并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；股骨髁關(guān)節(jié)軟骨采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（RTPCR）對(duì)軟骨組織中II型膠原COLII、X型膠原（COLX）、基質(zhì)金屬蛋白酶3、13（MATRIXMETALLOPROTEINASE，MMP3、13）、軟骨聚集蛋白聚糖（AGGRECAN）、RUNT蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNTRELATEDTRANIONFACTRUNX2等指標(biāo)進(jìn)行檢測，評(píng)估富含A2M血清對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷在基因?qū)用嫔系恼{(diào)控作用。采用ELISA檢測關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶（MATRIXMETALLOPROTEINASE，MMP13）濃度。結(jié)果1ACLT術(shù)后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的關(guān)節(jié)軟骨早期大體觀察與組織病理學(xué)觀察并無明顯的區(qū)別，但術(shù)后8周開始，實(shí)驗(yàn)組的關(guān)節(jié)軟骨退化明顯加重。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3天、1周、8周關(guān)節(jié)盥洗液中A2M的濃度較血清中的濃度明顯增高。并且實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3天關(guān)節(jié)液盥洗液中的A2M的濃度與對(duì)照組關(guān)節(jié)盥洗液中A2M濃度相比較明顯增高，術(shù)后1周開始迅速降低與對(duì)照組無差別。2采用超濾離心法制備的富含A2M血清（A2MRICHSERUMA2MRS）經(jīng)ELISA檢測結(jié)果為人的血清中A2M的濃度為243±066MGML富含A2M血清（A2MRS）中A2M的濃度為1952±437MGMLA2MRS中的A2M的濃度較正常血清中的濃度提高了804倍。蛋白免疫印跡（WESTERNBLOT）結(jié)果顯示富含A2M血清（A2MRS）相比正常血清在180KD處有非常明顯的蛋白濃聚現(xiàn)象。A2M蛋白活性檢測表明富含A2M血清（A2MRS）的A2M蛋白活性較正常血清A2M的活性提高213倍。3動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察A2MRS對(duì)PTOA關(guān)節(jié)軟骨退化的治療作用，通過熒光分子斷層成像系統(tǒng)（FLUESCENCEMOLECULARTOMOGRAPHY，F(xiàn)MT）檢測結(jié)果表明富含A2M血清（A2MRS）早期可以明顯抑制創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶3、13（MATRIXMETALLOPROTEINASE，MMP3、13）。膝關(guān)節(jié)的X光片的影像學(xué)表現(xiàn)ACLTSALINE組的髕骨下緣有明顯的骨贅增生，其余三組在影像學(xué)表現(xiàn)上均沒有觀察到明顯的退行性改變。印度墨水染色表明SHAMSALINE組中軟骨表面未見明顯損傷，ACLTSALINE組軟骨表面損傷最為嚴(yán)重，而ACLTA2MRS組關(guān)節(jié)面損傷明顯減輕，其中ACLTHA2MRS組中軟骨損傷在ACL切斷組中最小，改良MANKINS評(píng)分顯示ACLTHA2MRS組和ACLTLA2MRS與ACLTSALINE組相比較均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但ACLTHA2MRS組與ACLTLA2MRS組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脛骨平臺(tái)番紅O固綠染色、HE染色及甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果均顯示ACLTSALINE組軟骨厚度明顯變薄，軟骨表面有較多小的裂隙，軟骨細(xì)胞分布紊亂，糖胺多糖染色較差。ACLTLA2MRS組軟骨細(xì)胞聚集成團(tuán)，軟骨厚度降低，ACLTHA2MRS組中軟骨表面較為平滑，細(xì)胞排列較整齊，SHAMSALINE組軟骨表面完整，結(jié)構(gòu)良好，細(xì)胞分布均勻，糖胺多糖染色良好。OARIS評(píng)分顯示ACLTSALINE組為1015±288，ACLTHA2MRS組為554±261ACLTLA2MRS組為487±274，SHAMSALINE為305±139，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組（ACLTHA2MRS和ACLTLA2MRS）與陽性對(duì)照組（ACLTSALINE）均有顯著性差異（P在II型膠原的免疫組化染色上，ACLTHA2MRS組和ACLTLA2MRS組的陽性細(xì)胞明顯比ACLTSALINE組染色強(qiáng)，即ACLTHA2MRS組較ACLTLA2MRS組陽性細(xì)胞要強(qiáng)，但兩組II型膠原的免疫組化染色均低于SHAMSALINE組。在X型膠原和MMP13的免疫組化染色上，ACLTSALINE組陽性細(xì)胞在四組中表達(dá)最強(qiáng)，SHAMSALINE組的陽性細(xì)胞表達(dá)最弱，而兩個(gè)治療組ACLTHA2MRS組及ACLTLA2MRS組在X型膠原表達(dá)上介于ACLTSALINE組與SHAMSALINE組之間，并且同樣存在劑量依賴性，即ACLTHA2MRS的X型膠原的表達(dá)比ACLTLA2MRS組弱。RTPCR結(jié)果表明A2MRS具有較為明顯的抑制負(fù)性基因X型膠原（COLX）、基質(zhì)金屬蛋白酶3、13（MATRIXMETALLOPROTEINASE3、13，MMP3、13）、RUNT蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNTRELATEDTRANIONFACTRUNXN2的MRNA表達(dá)。關(guān)節(jié)液中MMP13的ELISA測定結(jié)果表明ACLTHA2MRS組、ACLTLA2MRS組與SHAMSALINE組中關(guān)節(jié)液中MMP13濃度均顯著低于ACLTSALINE統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異，但前三組之間組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論1關(guān)節(jié)液中A2M可以作為生物標(biāo)記物早期診斷創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎，術(shù)后一周關(guān)節(jié)液中A2M的迅速降低提示外源性的補(bǔ)充至關(guān)重要。2超濾離心法可高效便捷的制備具有較高蛋白濃度和蛋白活性的富含A2M血清。3富含A2M血清（A2MRS）具有較為明顯減緩關(guān)節(jié)軟骨退化的正性治療作用。

簡介：目的乙型肝炎病毒感染可引起急性、慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌，是重大的公共衛(wèi)生問題。臨床上，通過檢測HBV血清標(biāo)志物來輔助判斷HBV感染與否、評(píng)價(jià)預(yù)后、治療方案和藥物反應(yīng)等。HBSAG是感染乙型肝炎病毒后最早出現(xiàn)在血液中的標(biāo)志物，具有較強(qiáng)的免疫原性，是檢測乙型肝炎病毒感染情況的最重要的指標(biāo)之一。本課題目的為應(yīng)用分子生物學(xué)方法構(gòu)建抗HBSAG抗體并研究其生物學(xué)功能。方法實(shí)驗(yàn)室前期工作篩得一株抗HBSAG單鏈抗體，我們構(gòu)建了全抗體LPCDNA31HPCDNA31真核表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)染至293F細(xì)胞株，成功表達(dá)純化了抗HBSAG抗體HB192，應(yīng)用ELISA方法測定抗體的結(jié)合活性，通過測定HEPG2215細(xì)胞培養(yǎng)上清HBSAG的含量和HBVDNA拷貝數(shù)評(píng)估抗HBSAG抗體HB192的中和乙肝病毒的能力。結(jié)果我們成功構(gòu)建表達(dá)了具有較強(qiáng)的HBSAG結(jié)合活性和特異性的抗HBSAG單克隆抗體HB192，且HB192擁有極好地中和HBV的活性。結(jié)論我們成功構(gòu)建和表達(dá)了具有很強(qiáng)的結(jié)合活性和生物學(xué)功能的抗HBV中和性單克隆HB192。

簡介：ZHEJIANGSCITECHUNIVERSITYMASTERDISSERTATIONSTUDYONDOUBLESTRANDEDRNAVIRUSESINFECTINGRADISHTISSUECULTURE，CELLANDMOLECULARBIOLOGYOFVIRALINFECTEDSEEDLINGSQIANZHUOMAODIRECTEDBYDRCHENJISHUANG，PROFESSORDRHONGJIAN，PROFESSORHANGZHOU，CHINA課題來源國家自然基金項(xiàng)目116152A4A09631資助

簡介：THEBIOLOGICALCHARACTERISTICSANDMOLECULARMECHANISMOFCATHEPSINZANDCD97INGASTRIC?■■■CANCERCE兒LLNESANDCLIMCAUTHOR’SSIGNATURED●■‘SUPEMSOR7SSIGNATURETHESISREVIEWER1硼1ESISREVIEWER2THESISREVIEWER3THESISREVIEWER4THESISREVIEWER5⑧／廠而州乙A9～／T廠ANONYMOUSCHAIRZHANGSUZHAN，PROFESSORTHESECONDAFFILIATEDHOSPITALOFZHEJIANGUNIVERSITYCOMMITTEEOFORALDEFENCECOMMITTEEMAN1J沌YULIAN，PROFESSOR，THESECONDAFFILIATEDHOSPITALOFZHEJIANGUNIVERSITYCOMMITTEEMAN2．CAIJIANTING，PROFESSOR，THESECONDAFFILIATEDHOSPITALOFZHEJIANGUNIVERSITYCAOLIPING，PROFESSOR，THESHAOYIFUAFFILIATEDHOSPITALOFZHEJIANGUNIVERSITYCOMMITTEEMAN4．SHAOQINSHU，CHIEFPHYSICIAN，ZHEJIANGPROVINCEPEOPLE’SHOSPITALDATEOFORALDEFENCE2016．5．26浙江大學(xué)博士學(xué)位論文致謝致謝時(shí)間如梭，轉(zhuǎn)眼畢業(yè)在即?；叵朐谡憬髮W(xué)求學(xué)的過程，心中充滿了無限感激和留戀之情。感謝母校為我們提供良好的學(xué)習(xí)環(huán)境，使我們能夠在此專心學(xué)習(xí)。在此，謹(jǐn)向我的恩師陳力教授致以最誠摯的謝意在我攻讀博士學(xué)位期間，從論文選題、思路分析、實(shí)驗(yàn)實(shí)施、論文撰寫的全過程中都得到了恩師悉心的指導(dǎo)和幫助。陳老師精益求精的工作態(tài)度、嚴(yán)謹(jǐn)務(wù)實(shí)的科研作風(fēng)、謙虛寬忍的道德人品是我學(xué)習(xí)的榜樣。衷心感謝劉達(dá)人和李國剛在我畢業(yè)論文設(shè)計(jì)及寫作過程中所給予的耐心指導(dǎo)和無私幫助另外，我必須感謝李曉文等師兄弟、師妹在學(xué)習(xí)、實(shí)驗(yàn)中給予的幫助和支持，正是因?yàn)樗麄冊(cè)诟鞣矫娴臒o私幫助，我才能得以順利完成該論文。感謝在學(xué)習(xí)、工作、生活中所有曾經(jīng)關(guān)心幫助和支持鼓勵(lì)我的老師、同學(xué)。我要衷心感謝我的父母。焉得諼草，言樹之背，養(yǎng)育之恩，無以回報(bào)。作為他們的孩子，我秉承了他們樸實(shí)、堅(jiān)韌的性格，也因此我有足夠的信心和能力戰(zhàn)勝前進(jìn)路上的艱難險(xiǎn)阻；也因?yàn)樗麄兊娜找剐羷?，我才有機(jī)會(huì)如愿完成自己的學(xué)業(yè)。最后，我要感謝我的妻子及女兒多年來對(duì)我的理解和無私奉獻(xiàn)感恩之情，難以言表，謹(jǐn)致敬意。