簡介：簟781455碩士學(xué)位論文2005屆人B7一H3分子的克隆、表逮及其生物學(xué)功能的初步研究CLONE，EXPRESSIONOFHUMANB7一H3ANDTHESTUDYOFITSBIOLOGICALFUNCTIONS／NVITRO研究生姓名指導(dǎo)教師姓名申請學(xué)位級別專業(yè)名稱研究方向論文提交日期張光波張學(xué)光醫(yī)學(xué)碩士免疫學(xué)細胞免疫2005年5月人B7H3分子的克隆、表達囂其生物學(xué)功能的初步研究中文摘要因細胞株L929／B7．H3。利用上述構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細胞L929／B7．H3為免疫原，免疫BALB／C小鼠，采用B淋巴細胞融合技術(shù)，將反復(fù)免疫后的小鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2／0進行細胞融合，以此轉(zhuǎn)基因細胞作為陽性篩選細胞，以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的對照細胞L929／MOCK作為陰性對照細胞，篩選特異性分泌鼠抗人B7．H3單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人B7．H3單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為4H7和21D4。經(jīng)快速定性試紙法分析鑒定，4H7和21D4的重鏈均為IGGL而輕鏈均為K。以L929／B7．H3為競爭靶細胞，經(jīng)免疫熒光標(biāo)記的競爭抑制試驗顯示，4H7和21D4識別不同的抗原位點。利用自行研制的兩株鼠抗人B7．H3單克隆抗體，采用免疫熒光標(biāo)記及蛋白印跡實驗綜合分析B7一H3在腫瘤細胞株、外周血淋巴細胞上的蛋白表達譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B7．H3在幾乎所有上皮來源的腫瘤細胞株上都有著高水平的表達，而在其他來源的細胞株上都未檢測到B7．H3分子的表達；在靜止及活化后的B、T淋巴細胞上都未見B7．H3的表達，但B7．H3可穩(wěn)定表達在未成熟、成熟的單核細胞來源的DCS上。單核細胞經(jīng)過LPS、GM．CSF等刺激下，也可檢測到B7．H3的表達。同時分析了B7．I13在上皮來源的腫瘤新鮮組織上的表達情況。免疫組化結(jié)果顯示，在檢測的多數(shù)標(biāo)本上并未檢測到B7．H3的表達，但在癌旁組織呈現(xiàn)B7H3的表達。3．B7．1T3生物學(xué)功能的初步研究采用PCR的方法，將B7．H3胞外段基因和人IGGLFC段基因連接后，裝入真核表達載體PGEZ．TERM。重組載體PGEZ．TERM／B7．H3IG質(zhì)粒與兩個輔助病毒載體脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T，用含有完整病毒顆粒的293T細胞的培養(yǎng)上清培養(yǎng)L929細胞，使其被病毒感染，加入選擇性培養(yǎng)基進行篩選，挑選出穩(wěn)定表達B7．H3IG融合蛋白的L929細胞株。無血清培養(yǎng)上清經(jīng)PROTEING柱純化后，所得的蛋白行SDS．PAGE電泳呈現(xiàn)一條分子量約66KD的條帶且能該蛋白可被抗B7H3抗體識別。將反應(yīng)T細胞經(jīng)激發(fā)型CD3單抗及B7．H3IG聯(lián)合刺激后，共培養(yǎng)3D。3HTDR摻入法顯示，B7．H3IG融合蛋白能有效地促進T細胞增殖，且存在劑量依賴性。ELISA法檢測培養(yǎng)上清細胞因子表明，該融合蛋白能明顯促進T細胞對ILLO和IFNY的分泌。以上結(jié)果提示B7H3能在體外有效的介導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答，促進T細胞增殖、IL．10和IFNO的分泌。H

簡介：蘭州大學(xué)博士學(xué)位論文食管間質(zhì)瘤的分子生物學(xué)和臨床特征及其外科治療的研究姓名蔣鵬申請學(xué)位級別博士專業(yè)胸外科指導(dǎo)教師高秉仁赫捷20100501蘭州大學(xué)博士研究生學(xué)位論文外顯子13和外顯子17以及PDGFRA基因的外顯子12和外顯子18的突變情況，并結(jié)合臨床資料進行分析。結(jié)果從63例食管間葉源性腫瘤中確診了8例食管間質(zhì)瘤食管間質(zhì)瘤約占同期食管間葉源性腫瘤的12．7％。在這8例患者中，男女性別之比為53，患者發(fā)病的中位年齡為57歲，吞咽困難是最常見的癥狀。病變位置都在食管下三分之一段，其中5例發(fā)生在食管下段和胃食管交界處。所有患者都接受了手術(shù)治療，手術(shù)方式有兩種單純病變摘除術(shù)和食管大部切除、胃食管吻合術(shù)。術(shù)后病理檢查中均未發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)前、術(shù)后均未被診斷為食管間質(zhì)瘤。所有患者術(shù)前、術(shù)后均未接受過放、化療和甲磺酸伊馬替尼等輔助治療。中位隨訪時間為59個月。8例食管間質(zhì)瘤中有4例發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)，并死于本病，其中發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的2例患者均為肝臟轉(zhuǎn)移。8例食管間質(zhì)瘤標(biāo)本中測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)C．KIT基因的EXON11突變兩例，C．KIT基因的EXON9、EXON13、EXON17和PDGFRA基因的EXON12、EXON18均未發(fā)現(xiàn)突變。C．KIT基因的EXON11突變的兩例中，1例為堿基缺失突變558560位密碼子AAG、GTT、GTT缺失，另一例為點突變559位密碼子突變GTTGAT。結(jié)論1食管間質(zhì)瘤是一種比較少見的的食管間葉源性腫瘤，復(fù)發(fā)率和死亡率較高，尤其是腫瘤較大的患者9CM。術(shù)前診斷往往比較困難。2術(shù)后病理組織的免疫組織化學(xué)檢查是食管間質(zhì)瘤診斷與鑒別診斷的先決條件。常用的免疫標(biāo)記物有CDL17，CD34，SMA，S．100等。3外科手術(shù)依然是治療食管問質(zhì)瘤的主要的和首選的治療方法。成功的食5

簡介：TRAIL基因是近來發(fā)現(xiàn)的TNF家族新成員在人體的大多數(shù)器官和組織中都有表達因此推測TRAIL分子有著廣泛的功能目前認為TRAIL蛋白可能參與機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、體內(nèi)造血調(diào)節(jié)、巨噬細胞的平衡維持以及胚胎的免疫豁免成熟的TRAIL蛋白主要以膜結(jié)合或可溶性的形式酆可溶性的TRAIL蛋白是膜結(jié)合蛋白被蛋白酶水解的胞外活性部分為了進一步研究TRAIL基因的免疫生物學(xué)功能我們設(shè)計并進行了以下的實驗利用RTPCR技術(shù)我們分別從正常人的外周血淋巴細胞和腫瘤細胞株中獲得STRAIL基因并將目的基因插入含有AMP以及LACZ的測序載體PCR21并將含有目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5Α中進行大量擴增并鑒定經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)從腫瘤細胞株中獲得的目的基因序列與GENEBANK完全一致而淋巴細胞來源的基因序列的第905位與GENEBANK不同首次報道了正常人淋巴細胞和腫瘤細胞的STRAIL基因中的單堿基突變現(xiàn)象

簡介：該論文以環(huán)境總基因組DNA為研究切入點首先構(gòu)建了海水環(huán)境基因組DNA文庫在對己知褐藻膠裂解酶序列進行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計了簡并引物建立了一個簡便而有效的褐藻膠裂解酶基因PCR篩選法通過該方法篩選得到一條褐藻膠裂解酶新基因重組酶具有POLYM底物專一性該研究為實現(xiàn)褐藻膠的酶法降解奠定了基礎(chǔ)該論文以該ALGL基因為研究切入點從海水中篩選得到一株高產(chǎn)褐藻膠的海洋假單胞細菌克隆了褐藻膠生物合成操縱元基因的全序列進行了生物信息學(xué)分析由于細菌褐藻膠生物合成途徑已經(jīng)比較清晰該操縱元全序列的克隆和分析為利用DNA重組技術(shù)改建細菌固有的褐藻膠生物合成途徑、獲得新型褐藻膠多糖或者寡糖、實現(xiàn)褐藻膠的生物轉(zhuǎn)化奠定了分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)

簡介：中山大學(xué)博士學(xué)位論文中國非小細胞肺癌患者EGFR雙突變的分子流行病學(xué)及生物學(xué)特性研究姓名張國淳申請學(xué)位級別博士專業(yè)腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師吳一龍20070430LL_L冉I寧竹論上。IⅢ扯小細胞種艋吉占EGFR“突變的舒F贏J抽卞，乏’L物卞持性研宄I正捕霍突變的分了流IJ病學(xué)研究，了解EGFR雙突變的分布規(guī)律并進步通過仆外實驗明確其生物學(xué)釣性以指導(dǎo)臨床個體化TKI治療的用藥選擇。方法1非選擇性中國人NSCLC患者肺癌組織標(biāo)本的EGFR測序2004年1月至2005年7月期間，“東省人民醫(yī)院腫瘤巾心收治的非小細H色I肺癌患者，采用TRIZOL法及石蠟包埋組織DNA提取法獲得所有標(biāo)本的皋岡DNA進行PCR測序。除對EGFR的18，19，21外顯F測序外，接受過GEFITMIB治療的病例還進行KRAS第2顯子及EGFR笫20外顯子的耐藥性突變榆測。2EGFR雙突變的等位基因定位實驗提取攜帶EGFR雙突變的肺癌組織的總RNA進行EGFRL821外顯F全K的RTPCR，并使用PMDL8T載體進行TA克隆測序，分析EGFR雙突變的等位毖因分卻情況。3EGFR雙突變表達載體的構(gòu)建利用STRATAGENE公司開發(fā)的QUICKCHANGEXL定點突變試劑盒將L858R定點突變劍己插入了EGFRDELE746一A750的PEDNA31一表達載體上，從而構(gòu)建EGFRDELE746A750／L858R雙突變表達載體。通過雙酶切及EGFR開放讀碼柜全長測序進行鑒定。4TKIS藥敏實驗將構(gòu)建成功的EGFR雙突變以及DELE746A750，L858R兩種單突變載體與野生型載體通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的方法分別瞬時轉(zhuǎn)染至293T細胞中。轉(zhuǎn)染40小時后以分別以GEFITINIB與ERLOTINIB濃度梯度處理3小時。處理完成后以EGF刺激誘導(dǎo)EGFR磷酸化。收集細胞提取總蛋白進行EGFRTYRL068位點磷酸化的WESTERNBLOTTING檢測。使用QUANTITYONE光密度分析軟件對WESTERNBLOTTING的結(jié)果進行分析，獲得EGFR磷酸化被TKIS抑制程度的比值，并作圖比較。5EGFR雙突變體對P13K／AKT信號傳導(dǎo)通路效應(yīng)的初步研究將上述4種EGFR表達載體瞬時轉(zhuǎn)染至293T細胞中。轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞提取總RNA行P13K及AKT兩種基因的災(zāi)時熒光定量PCR，并比較4種轉(zhuǎn)染后細胞中以EGFR轉(zhuǎn)錄水平校正后的這柏種基因轉(zhuǎn)錄水平，初步了解EGFRⅡ

簡介：點擊查看更多大鼠腎移植后肝組織中凋亡相關(guān)細胞因子的分子生物學(xué)研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：呼吸道合胞病毒RESPIRATYSYNCYTIALVIRUSRSV簡稱合胞病毒是重要的嬰幼兒急性呼吸道感染病原體可引起間質(zhì)性肺炎及毛細支氣管炎等疾病。RSV感染非常普遍超過90％的兒童在2歲以前感染過RSV而且都經(jīng)歷過1次或多次感染。在發(fā)展中國家5歲以下兒童因RSV感染住院病人的死亡率為7％發(fā)達國家為05％20％。我國RSV感染研究缺乏全國資料部分地區(qū)資料顯示北京市兒童醫(yī)院研究顯示在19961999年期間住院的病人中有呼吸道感染癥狀病例1183例RSV陽性者標(biāo)本255例占送檢標(biāo)本總數(shù)的215％沈陽地區(qū)19992000年調(diào)查顯示小兒急性呼吸道感染病例的4462％由RSV引起。我省尚未開展RSV感染的病原學(xué)研究僅僅開展了RSVIGM抗體的檢測工作也沒有對于嬰幼兒急性呼吸道感染病例的病原學(xué)流行趨勢的研究。為了了解河南省嬰幼兒急性呼吸道感染病例病原學(xué)分布狀況探討呼吸道合胞病毒在我省的流行規(guī)律積累呼吸道合胞病毒毒株了解呼吸道合胞病毒黏附蛋白G基因的分子生物學(xué)特征確定我省呼吸道合胞病毒分離株的型別從而填補我省呼吸道合胞病毒病原學(xué)研究的空白我們設(shè)立并開展了此項研究工作。另外通過對呼吸道合胞病毒各種檢測、鑒定方法的對比比較各種檢測方法檢測效果的差異在尋找呼吸道合胞病毒快速檢測方法、建立應(yīng)急檢驗平臺等突發(fā)公共衛(wèi)生事件的預(yù)防控制工作方面提供可靠的實驗室數(shù)據(jù)支持。材料與方法研究對象來源于2006年10月2007年5月期間河南省人民醫(yī)院兒科門診和住院病例以及河南省流感樣病例監(jiān)測系統(tǒng)中的病例對診斷為急性支氣管炎、毛細支氣管炎、肺炎符合篩選條件的病例確定為研究對象。對研究對象進行調(diào)查并采集咽拭液標(biāo)本選擇HEP2、VERO細胞系采用組織培養(yǎng)的方法在咽拭液標(biāo)本中分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒株運用相關(guān)試劑盒提取咽拭液標(biāo)本RNA模板采用AGELISA、REALTIMEPCR等方法鑒定呼吸道合胞病毒。設(shè)計并合成針對RSV黏附蛋白G基因的上下游引物對鑒定陽性病例運用RTPCR方法擴增該基因陽性擴增產(chǎn)物運用核苷酸測序方法獲得G基因全長核苷酸序列將所獲得的序列與已知參考毒株G基因序列一同導(dǎo)入DNASTAR軟件進行同源性分析和系統(tǒng)進化樹分析。運用卡方檢驗等相關(guān)統(tǒng)計學(xué)方法比較各檢測方法的敏感性差異結(jié)合實際工作找出快速實用的檢測方法。結(jié)果通過收集和篩選資料共有126例病例符合本研究所規(guī)定的條件對所有研究對象進行調(diào)查和采集臨床標(biāo)本共采集咽拭液標(biāo)本126份。經(jīng)過組織培養(yǎng)共有58份標(biāo)本出現(xiàn)CPE其中5份為典型細胞融合病變53份為其他細胞病變。經(jīng)過REALTIMEPCR方法鑒定出12份為呼吸道合胞病毒經(jīng)過AGELISA鑒定出8份呼吸道合胞病毒通過針對黏附蛋白G蛋白基因的引物的RTPCR反應(yīng)共有6份標(biāo)本擴增出了陽性條帶對這6份病毒標(biāo)本的RTPCR擴增產(chǎn)物進行了核苷酸序列測定獲得這些病毒的G蛋白基因全長核苷酸序列分別編號為HENAN2006A36、HENAN2006A39、HENAN2006207、HENAN2006305、HENAN2006417、HENAN2006589其核苷酸序列長度均為922BP。將所得到的核苷酸序列導(dǎo)入DNASTAR軟件MEGALIGN模塊中進行核苷酸序列同源性分析通過分離毒株序列兩兩比較其同源性最大99％最小88％將所測核苷酸序列推導(dǎo)出氨基酸序列進行同源性比較同源性在90％95％之間其與RSVA型毒株序列同源性為87％94％與RSVB型毒株序列同源性33％35％。從PUBMED基因數(shù)據(jù)庫中查找并下載多條RSV毒株G蛋白基因核苷酸參考序列與樣本序列導(dǎo)入DNASTAR軟件MEGALIGN模塊中進行比較并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹確定病毒型別。通過比較不同的RSV鑒定方法實驗結(jié)果表明共檢測12株呼吸道合胞病毒其中組織培養(yǎng)分離出5株病毒REALTIMEPCR檢出12株病毒AGELISA檢出8株病毒對上述數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理檢出率經(jīng)配對卡方檢驗REALTIMEPCR和AGELISA兩種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義P010Χ2225檢測敏感性沒有顯著性差異都可以用來進行快速檢測。結(jié)論1通過檢測結(jié)果的比較REALTIMEPCR實驗與AGELISA實驗對于呼吸道合胞病毒的檢測檢測敏感性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2在我省部分地區(qū)20062007年度嬰幼兒急性呼吸道感染病例中RSV感染毒株以A型毒株為主。

簡介：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院）博士學(xué)位論文細支氣管肺泡癌的分子生物學(xué)研究姓名繆若羽申請學(xué)位級別博士專業(yè)臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師李龍蕓20080601中文摘要研究背景細支氣管肺泡癌BAC是肺腺痛中的一個亞型，具有單純細支氣管肺泡生長模式，而沒有基質(zhì)、血管或胸膜侵犯的證據(jù)。據(jù)報道，腺癌伴BAC特征和BAC局灶浸潤性腺癌與單純BAC的預(yù)后的相類似，均明顯好于其他腺癌患者。近年來一些發(fā)達國家的研究資料提示，BAC的發(fā)生率呈明顯上升趨勢。靶向治療是近年腫瘤學(xué)界韻研究熱點之一，大型研究顯示，對EGFRTKI敏感的患者傾向于為腺癌或BAC，這使得對該NSCLC亞型，特別是其與EGFR之問關(guān)系的研究興趣有了相當(dāng)程度的提高。人乳頭瘤病毒HPV是一類嗜上皮的DNA致瘤病毒。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不斷有從肺癌組織中檢出HPVDNA相關(guān)序列的文獻報道。但HPV感染與肺癌發(fā)牛的關(guān)系，目前說法不一。目的探索BAC分子生物學(xué)特點，包括EGFRTK結(jié)構(gòu)域的突變、EGFR和HER2的基因拷貝數(shù)和蛋白表達，探討它們與BAC的發(fā)生發(fā)展、治療反應(yīng)以及預(yù)后的關(guān)系，并探討HPV感染在BAC發(fā)生中的作用。方法采用PCR和DNA測序法檢測中國人BAC右蠟包埋組織標(biāo)本EGFR基兇突變情況，PCR和EGFR突變檢測試劑盒檢測BAC患者外周咖EGFR基因突變情況，熒光原位雜交法FISH檢測組織標(biāo)奉中癌細胞的EGFR和HER2基因拷貝數(shù)，免疫組織化學(xué)法IHC檢測EGFR和HER2的蛋白表達，PCR和DNA原位雜交法ISH檢測HPVDNA，實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSSL40軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果BAC組織標(biāo)本中EGFR基因突變牢50％16／32，其中7例占438％為外顯子19上的缺失突變，L例62％為D807N，850％為L858R；EGFR基因突變與性別PO476、吸煙情況PO414、病理亞型P0151和EGFR蛋白表達PO231沒有顯著相關(guān)性，與EGFR基因拷貝數(shù)有非常顯著的相關(guān)性PO001。8例外周血EGFR檢測中5例625％檢測到EGFR基因突變，包4

簡介：蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究小鼠急、慢性肝損傷姓名齊蕊申請學(xué)位級別碩士專業(yè)生物物理學(xué)指導(dǎo)教師王勤20060501蘭卅L大學(xué)碩士研究生論文應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究小鼠急、慢性肝損傷摘要小鼠酒精性肝損傷分子生物學(xué)檢測指標(biāo)的探討目前酒精性肝損傷的發(fā)病率呈逐年上漲趨勢，對酒精性肝病的診斷需要多種指標(biāo)相互驗證。本文擬探討若干基因作為肝損傷分子生物學(xué)檢測候選指標(biāo)的可行性。首先取小鼠120只隨機分成正常組和肝損傷模型組，連續(xù)給與模型組小鼠灌喂酒精。于第6周、第12周檢測到模型組小鼠血清AUL活性有所升高，TP、ALB含量顯著下降，而GLB含量無明顯變化；肝組織病理切片顯示肝細胞結(jié)構(gòu)被破壞，有脂肪變性以及淋巴細胞浸潤等特征。提示酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型成立。然后分別提取模型組和正常組小鼠肝組織RNA，經(jīng)SMART技術(shù)反轉(zhuǎn)錄成CDNA。在正常組和模型組CDNA中，用PCR擴增CDL4、LBP、MCP．1、ICAM一1、IL．10、OPN6個基因片斷。結(jié)果顯示以上基因在模型組中的表達均顯著高于正常組；且隨損傷程度加深，LBP、MCP一1、1CAM．1、IL．10表達量亦呈增加趨勢。因此，這些基因可作為用分子生物學(xué)方法檢測酒精性肝損傷的候選指標(biāo)。本實驗為在分子水平上進行肝損傷的檢測提供理論依據(jù)。用SSH方法構(gòu)建CCH誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷組織與正常肝組織差異表達基因的CDNA文庫本文利用抑制性消減雜交方法構(gòu)建了CCI。誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷組織與正常肝組織差異表達基因的CDNA文庫。首先建立CCL4誘導(dǎo)急性肝損傷的小鼠模型小鼠腹腔注射40％CCH花生油溶液4060，16H后檢測到血清中AST、』6止T活性均明顯升高，TP、ALB含量顯著下降，GLB含量無明顯變化；病理切片顯示肝細胞有氣球樣變性、小葉結(jié)構(gòu)模糊、血管充血、部分淋巴細胞浸潤。提示CCI。誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型成立。然后我們在該模型中尋找與正常鼠肝組織差異表達的基因并構(gòu)建消減CDNA文庫1分別提取肝組織MRNA，用SMART技術(shù)反轉(zhuǎn)錄成CDNA，經(jīng)過酶切、接頭連接、兩輪消減雜交及兩輪抑制性PCR，使得差異表達的CDNA片段得以富集；2用T／A克隆構(gòu)建差異表達基因的CDNA消減文庫；3隨機挑選60個陽性克隆進行PCR鑒定，其中有55個克隆有200．750BP的插入片斷，證實建庫成功。該CDNA文庫的構(gòu)建為進一步篩選出代表急性肝損傷組織與正常肝組織差異表達的CDNA片段，并對這些CDNA進行序列測定、序列同源性分析以及進行完整基因的克隆、鑒定奠定了基礎(chǔ)；為基因藥物和診斷基因芯片的研發(fā)提供了依據(jù)。關(guān)鍵詞酒精性肝損傷、CCL4誘導(dǎo)的急性肝損傷、基因的差異表達、CDNA文庫、抑制性消減雜交SSH

簡介：1F905鑫3菪分類號R7566單位代碼10159學(xué)號200340094中回鏨升大拳碩士學(xué)位論文具有研究生畢業(yè)同等學(xué)力申請學(xué)位人員題目應(yīng)用巢式PCR進行申克孢子絲菌的分子生物學(xué)鑒定IDENTIFICATIONOFSPOROTHIXSCHENCKIIBYNESTEDPCRASSAY申請人徐天華推薦人簽堡塋論文課題起止時間2005年4月一2006年3月論文完成時間2006年5月應(yīng)用巢式PCR進行申克孢子絲菌的分子生物學(xué)鑒定目的探討孢子絲菌病的分子生物學(xué)快速診斷方法。材料及方法一、實驗材料1實驗菌株臨床分離的申克孢子絲菌38株其中中國15株，日本1L株，美國4株，委內(nèi)瑞拉3株，阿根廷2株，澳大利亞、南非、法國各1株，MTDNA型1～24均包括其中。克柔念珠菌、白念珠菌、馬爾尼菲青霉、煙曲霉、疣狀瓶霉、甄氏外瓶霉、皮炎外瓶霉、新型隱球菌、須癬毛癬菌、卡氏枝孢霉菌種各L株，均為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所保存菌株。CEMTOCYSTISMINOR2株，均為日本TOKYO醫(yī)學(xué)真菌研究所保存菌株。2實驗動物10只BALB／C小鼠，實驗動物體重22G～249，8～10W，購自遼寧省實驗動物中心。小鼠被分為兩組，1組雄性5只，1組雌性5只。3臨床標(biāo)本9個經(jīng)真菌培養(yǎng)確診的人孢子絲菌病的病理活檢標(biāo)本來自于本科。二、實驗試劑1基因組DNA提取主要試劑基因組DNA提取液CTABHEXADECYLTRIMETHYL刪ONIUMBROMIDE，十六烷基三甲基溴化銨。2PCR主要試劑21真菌特異性外層引物SS。和SS22真菌特異性內(nèi)層引物SS，和SS。3動物實驗試劑31標(biāo)準(zhǔn)菌株A‘RCCL0268申克孢子絲菌菌懸液1一一叵匱～文一～中～一；，L

簡介：背景和目的槲皮素是一種廣泛存在于自然界（如蔬菜、水果及其他日常飲食）中的具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤和神經(jīng)保護作用的黃酮類化合物。大量研究表明槲皮素可通過改變反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞基因的表達來保護神經(jīng)元和減少神經(jīng)變性疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，探究槲皮素對劃痕愈合的影響及其作用機制，將為我們后續(xù)研究槲皮素和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞在腦損傷中的作用奠定基礎(chǔ)，也為膠質(zhì)疤痕的形成機理提供新的研究思路。膠質(zhì)成熟因子，是由142個氨基酸殘基組成的分子量為17KDA的蛋白質(zhì)小分子，主要包括膠質(zhì)成熟因子ΒGMFB和膠質(zhì)成熟因子ΓGMFG。GMFB主要表達分布于脊椎動物的大腦中，在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的生長和分化中起了重要的調(diào)節(jié)作用。GMFG，膠質(zhì)成熟因子家族的一個新成員，其基因序列和氨基酸序列和GMFB具有高度的相似性（在大鼠中，其基因水平的相似度達71％氨基酸序列的相似度達789％），故將其命名為膠質(zhì)成熟因子Γ。GMFG的表達分布與GMFB的表達分布不同，GMFG高度表達分布在造血系統(tǒng)（包括粒細胞性白血病和淋巴細胞性白血病）、胸腺、脾臟、胚胎的肝臟及肺臟中，GMFG的進化與有分化和增殖潛能的造血免疫系統(tǒng)的進化同步。GMFG在神經(jīng)和大腦中的表達分布并不比其他組織中高，大鼠大腦中GMFG的MRNA可在大腦海馬CA3區(qū)的錐體細胞中檢測到5。GMFG在大鼠（鼠齡為E14P1）的視網(wǎng)膜的內(nèi)限膜中也可被探測到，對其膠質(zhì)細胞的生長和分化可能起了重要作用。但是到目前為止，GMFG在大腦中詳細的表達分布狀況及其功能仍然未知。近年來更多的研究聚焦于槲皮素的抗腫瘤作用，研究表明槲皮素可誘導(dǎo)多種腫瘤細胞的凋亡如白血病細胞、胰腺癌細胞等?？谇击[狀上皮癌，是世界上第六種最常見的惡性腫瘤外科手術(shù)和放療化療是治療口腔鱗狀上皮癌的最佳選擇方案，但口腔上皮癌細胞的多重耐藥性是其化療根治和化療失敗的一大難題。PGLYCOPROTEINPGP是介導(dǎo)腫瘤細胞多重耐藥的主要機制之一，大量研究顯示槲皮素能抑制PGP的表達，降低多種腫瘤細胞的耐藥性，如人胰腺癌細胞和CACO2細胞而是否槲皮素可以抑制口腔鱗狀上皮癌的生長，并通過降低PGP的表達來逆轉(zhuǎn)其多重耐藥性目前尚不清楚。本研究分為以下三個部分第一部分、槲皮素抑制膠質(zhì)疤痕愈合的分子生物學(xué)機制的探究一、實驗?zāi)康慕Ⅲw外星形膠質(zhì)細胞的遷移模型，探究槲皮素對劃痕愈合及其對膠質(zhì)疤痕中星形膠質(zhì)細胞增殖和遷移的影響，并探究其可能的分子生物學(xué)機制，為膠質(zhì)疤痕的治療尋找一種潛在的藥物。二、實驗方法1星形膠質(zhì)細胞GFAP染色鑒定原代星形膠質(zhì)細胞經(jīng)GFAP免疫熒光染色后進行純度鑒定，陽性細胞達95％以上，符合實驗要求。2體外星形膠質(zhì)細胞遷移模型的建立及應(yīng)用實驗分為三組，第一組為對照組C組，僅作劃痕處理第二組為劃痕加DMSO處理組（D組），第三組為劃痕加槲皮素處理組（Q組）劃痕操作如下，于35MM培養(yǎng)皿的蓋上劃出縱橫交錯的九道格，將蓋置于膠質(zhì)細胞培養(yǎng)皿下面，用10ΜL加樣器槍頭沿蓋上的格橫豎各劃九道，換液除去脫落細胞，然后置于5％的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每組三個培養(yǎng)皿。在低倍鏡下拍照，并通過NISELEMENTSD軟件測量劃痕的寬度，以此作為該視野劃痕的寬度計算其遷移指數(shù)。遷移指數(shù)的計算公式為IX3LXLCLDLQ。3WESTERNBLOT通過WESTERNBLOT分析槲皮素對CASPASE3、ERK12及PERK12蛋白表達的影響然后通過GELPROANALYZERALPHAINNOTECHCP，CA分析軟件，對蛋白的表達狀況進行定量分析（目的蛋白內(nèi)參蛋白）。4LIVEDEAD染色培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細胞用PBS洗三遍以后，取200ΜLLIVEDEAD混合標(biāo)記液加入到各組培養(yǎng)皿中進行避光染色15MIN后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察活細胞（呈綠色）和損傷細胞（呈紅色）的情況。5CLICKITEDUTEST培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細胞半量換液，加入1ML含20ΜMOLLEDU的全培養(yǎng)液。將其置于37℃，5％的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24H后棄去培養(yǎng)液，加入1ML37％甲醛室溫下固定15MIN，用3％BSA洗兩遍。然后再加入1ML05％TRITONX100室溫下孵育20MIN用3％BSA洗兩遍。然后加入05MLCLICKIT反應(yīng)混合液，室溫下避光振蕩30MIN。用3％BSA洗一遍然后再加入1ML1HOECHST33342反應(yīng)液室溫下避光反應(yīng)30MIN。用PBS清洗兩次后，激光共聚焦顯微鏡下拍照分析并計算其增殖細胞百分比，以上實驗隨機重復(fù)3次。6細胞周期分析將處理后的星形膠質(zhì)細胞用025％胰酶37℃消化5MIN，收集的懸浮細胞室溫下1500RMIN離心5MIN。棄上清，加入250ΜL胰酶溶液（A液），混勻后，室溫下反應(yīng)10MIN。然后再加入200ΜL的胰酶抑制劑和核糖核酸酶的混合液（B液），混勻后，室溫下反應(yīng)10MIN。最后加入200ΜL冰冷的PI染液C液，混勻后，4℃避光反應(yīng)10MIN然后將其在3H內(nèi)上流式細胞儀檢測。三、實驗結(jié)果1槲皮素對體外星形膠質(zhì)細胞劃痕愈合的影響與對照組相比，槲皮素50ΜMOLL能明顯抑制劃痕的愈合，在6H時就有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，而DMSO對劃痕的愈合無影響在第72H時C組和D組的部分視野已開始愈合。2槲皮素對星形膠質(zhì)細胞生存的影響LIVEDEAD染色后鏡下觀察C組、D組和Q組的細胞均為綠色活細胞，生長狀況良好。這說明該濃度槲皮素（50ΜMOLL）對星形膠質(zhì)細胞沒有毒性作用，對其死亡無影響。3槲皮素對星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響免疫熒光染色和WESTERNBLOT檢測顯示槲皮素（50ΜMOLL）對凋亡蛋白酶的表達無影響，以上研究表明槲皮素（50ΜMOLL）對星形膠質(zhì)細胞的凋亡無影響。4槲皮素對星形膠質(zhì)細胞增殖和細胞周期的影響與對照組相比，槲皮素能明顯抑制星形膠質(zhì)細胞的增殖，對照組星形膠質(zhì)細胞的增殖比例是槲皮素處理組的10倍以上。槲皮素處理24H后，G1期星形膠質(zhì)細胞的比例由8204％增加到9206％，而S期和G2期的比例相應(yīng)降低。以上數(shù)據(jù)表明槲皮素可通過抑制星形膠質(zhì)細胞DNA的合成來抑制其增殖。5槲皮素可通過降低ERK12的磷酸化水平來抑制星形膠質(zhì)細胞的遷移與對照組相比，第24H時槲皮素50ΜMOLL能使ERK12的磷酸化水平降低大約45％，此外，槲皮素對ERK12磷酸化水平的影響有一定的時間和濃度依賴性。隨時間的變化，ERK12的磷酸化水平逐漸降低，第12H時ERK12的磷酸化水平降到了最低，此后開始回升。在0100ΜMOLL的濃度范圍內(nèi)，隨著槲皮素的濃度增加，ERK12的磷酸化水平逐漸降低。U0126可明顯降低ERK12的磷酸化水平，并且可明顯抑制星形膠質(zhì)細胞體外劃痕的愈合。用磷酸酶抑制劑，釩酸鹽，維持槲皮素處理過的星形膠質(zhì)細胞的ERK12的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)釩酸鹽可逆轉(zhuǎn)槲皮素抑制劃痕愈合的效應(yīng)。四、實驗結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的槲皮素（50ΜMOLL）對膠質(zhì)劃痕中星形膠質(zhì)細胞的生存和凋亡無影響，槲皮素可通過抑制膠質(zhì)劃痕中星形膠質(zhì)細胞的增殖和遷移來抑制劃痕的愈合。第二部分、膠質(zhì)成熟因子在大鼠大腦中的表達狀況分析及其功能的初步探究一、實驗?zāi)康姆治鯣MFG蛋白在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達狀況，比較GMFB和GMFG在大腦組織和細胞中的表達和分布狀況，探究GMFG在星形膠質(zhì)細胞中的功能。二、實驗方法1細胞培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)、大鼠神經(jīng)元的培養(yǎng)、大鼠膠質(zhì)瘤9L和C6細胞系的培養(yǎng)。2人膠質(zhì)瘤及其正常大腦組織樣品所有人膠質(zhì)瘤及其正常大腦組織樣品（共22例）均取自于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科。3免疫熒光染色用細胞免疫熒光染色檢測GMFB和GMFG在原代星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元上的表達情況。4WESTERNBLOT通過WESTERNBLOT檢測GMFB和GMFG在原代星形膠質(zhì)細胞及大腦組織中表達狀況。5免疫組化通過免疫組化染色探究GMFB和GMFG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達分布狀況。6REALTIMEPCR通過熒光定量PCR檢測GMFB和GMFG在不同細胞系或不同組織中基因水平上的變化7免疫共沉淀通過免疫共沉淀探究并分析星形膠質(zhì)細胞中GFAP和GMFBGMFG相互作用。三、實驗結(jié)果1GMFB和GMFG在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達狀況分析本研究從基因、蛋白及細胞水平上第一次證明了GMFG在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達及存在，免疫熒光染色顯示GMFB主要表達分布于星形膠質(zhì)細胞的細胞核中，幾乎所有細胞均表達GMFB而GMFG表達分布于星形膠質(zhì)細胞的細胞核與細胞質(zhì)中，GMFG在細胞質(zhì)中的表達以細胞核為中心向細胞質(zhì)的四周放射。2GMFB和GMFG在大鼠大腦中的區(qū)域依賴性分布免疫組化結(jié)果表明，GMFB在大腦中分布廣泛，尤其是在海馬的錐體細胞中表達最為明顯。相比之下，GMFG并不是在整個大腦中都可探測到，僅可在部分細胞中探測到，GMFG在海馬的錐體細胞中表達最強，其次是大腦髓質(zhì)層和大腦的基底核，在大腦皮質(zhì)的表達最弱。3GMFB和GMFG在大鼠大腦中的年齡依賴性表達GMFB的MRNA表達水平明顯高于GMFG，GMFB的MRNA表達水平從出生后的第7天開始明顯下降，出生后的第8個月達到最低而GMFG的MRNA表達水平在出生后的第7天達到了最高峰，此后開始下降，出生后的第8個月達到最低。在出生后的第7天GMFB蛋白的表達量達到了高峰，隨后開始降低，1個月后趨于穩(wěn)定而GMFG蛋白的表達量在出生后一直降低。4GMFB在星形膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)瘤細胞上的表狀況分析結(jié)果顯示GMFB在大鼠膠質(zhì)瘤細胞細胞核上的表達增強，在細胞質(zhì)中的表達無明顯變化。前面的研究已證實隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟，GMFB在星形膠質(zhì)細胞上的表達逐漸減弱。膠質(zhì)瘤細胞作為一種未成熟和未分化的膠質(zhì)細胞在其細胞核上呈現(xiàn)出高表達。因此推測可能存在一個負反饋調(diào)節(jié)機制，在星形膠質(zhì)細胞的成熟和GMFB的表達之間存在重要的調(diào)節(jié)作用。正因為這種負反饋調(diào)節(jié)機制導(dǎo)致了GMFB在膠質(zhì)瘤細胞系9L和C6細胞核上的高表達。5GMFG在星形膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)瘤細胞上表狀況分析結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤細胞中GMFG無論是在MRNA水平上還是蛋白水平上的表達狀況均明顯低于其在星形膠質(zhì)細胞上的表達水平。除此之外，通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)GMFG在膠質(zhì)瘤細胞上的表達強度明顯低于其在星形膠質(zhì)細胞上的表達強度。研究顯示GMFG和GFAP之間確實存在某種相互作用，而GMFB和GFAP之間無該種相互作用。6GMFG在人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本上的表達狀況分析免疫組化實驗結(jié)果顯示4580％的正常腦組織標(biāo)本呈陽性，475714％Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本呈陽性。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的陽性率顯著低于正常腦組織標(biāo)本X265，P＜005，費舍爾確切概率法在陽性標(biāo)本中，不管細胞類型如何，GMFG在細胞質(zhì)和細胞核中均呈現(xiàn)陽性。WESTERNBLOT結(jié)果顯示，與正常大腦組織標(biāo)本相比，Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的表達水平明顯下降。四、實驗結(jié)論本研究從基因、蛋白及細胞水平上第一次證明了GMFG在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的存在，比較了GMFB和GMFG在大鼠大腦中的組織分布狀況，發(fā)現(xiàn)其在大鼠大腦中的分布具有區(qū)域依賴性，其表達具有時間依賴性此外，本研究發(fā)現(xiàn)GMFB和GMFG在正常的大鼠星形膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)瘤細胞系之間表達狀況的差異，并進一步證實了其在人正常的腦組織和Ⅳ級膠質(zhì)瘤標(biāo)本上的表達狀況之間的差異。本研究第一次提出了GMFB在膠質(zhì)細胞中表達狀況的負反饋調(diào)節(jié)機制，并對GMFG在膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)化中的作用做了初步探究。第三部分、槲皮素對KBV細胞及其耐藥機制的影響一、實驗?zāi)康奶骄块纹に貙δ烷L春新堿的口腔鱗狀上皮癌KBV細胞系侵襲、遷移、增殖及其凋亡的影響，進一步分析槲皮素降低耐藥相關(guān)蛋白PGP表達后KBV細胞對長春新堿的敏感性。二、實驗方法1細胞培養(yǎng)人KBV細胞細胞系采用含10％的胎牛血清、200NMOLLVCR的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2TRANSWELL體外遷移實驗將饑餓1224H后的KBV細胞制備細胞懸液，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗12遍，用含01％FBS的1640配養(yǎng)基重懸細胞，將細胞密度調(diào)至于5X104。取200ΜL細胞懸液加入TRANSWELL上室，含10％FBS的1640培養(yǎng)基500ΜL加入下室。37℃5％的CO2培養(yǎng)12H后，用棉簽擦去上室內(nèi)細胞，多聚甲醛固定10分鐘，01％結(jié)晶紫室溫孵育10MIN，清水漂洗3遍以上。TRANSWELL小室翻過來底面朝上置顯微鏡下觀察、拍照并計數(shù)。3TRANSWELL體外侵襲實驗將用1640做1∶5稀釋后的MATRIGEL涂于細胞生長面，150200ΜLCM2，37℃作用30分鐘，備用。將饑餓1224H后的KBV細胞制備細胞懸液，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗12遍，用含01％FBS的DMEM配養(yǎng)基重懸細胞，將細胞密度調(diào)至于5X104個CM2。取200ΜL細胞懸液加入TRANSWELL上室，取含10％FBS的1640培養(yǎng)基500ΜL加入下室。37℃，5％的CO2培養(yǎng)36H后，用棉簽擦去MATRIGEL和上室內(nèi)細胞，多聚甲醛固定10分鐘01％結(jié)晶紫室溫染色10分鐘，清水漂洗3遍以上。TRANSWELL小室翻過來底面朝上置顯微鏡下觀察拍照計數(shù)。4ΜTT測定細胞的生長取5103個細胞接種于96孔板上，待細胞貼壁后將培養(yǎng)基移去，分別加入200ΜL含濃度為0、25、50、75和100ΜMOLL槲皮素的10％FBSRPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)12H、24H和48H后，每孔中加入20ΜL5MGML的34，5二甲基噻唑22，5二苯基四氮唑溴鹽MTT繼續(xù)培養(yǎng)4H，然后用200ΜL加樣槍將液體小心地移去，每孔加入二甲基亞砜DMSO150ΜL，微振蕩器振蕩10MIN，用SPECTRAMAXM5多功能酶標(biāo)儀在490NM波長下測光密度值。每組設(shè)6個重復(fù)孔，重復(fù)三次試驗。5CLICKITEDU檢測將處理好的KBV半量換液，加入1ML含20ΜMOLLEDU的全培養(yǎng)液，其最終工作濃度為10ΜMOLL。將其置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24H后棄去培養(yǎng)液，加入1ML37％甲醛室溫下固定15MIN，棄去固定液，用3％BSA洗兩遍。然后再加入1ML05％TRITONX100室溫下孵育20MIN棄去通透液，用3％BSA洗兩遍。然后加入05MLCLICKIT反應(yīng)混合液，室溫下避光振蕩30MIN。棄去反應(yīng)液，用3％BSA洗一遍。然后再加入1ML1XHOECHST33342反應(yīng)液室溫下避光反應(yīng)30MIN。用PBS清洗兩次后，激光共聚焦顯微鏡下拍照分析并計算其增殖細胞百分比，以上實驗隨機重復(fù)3次。6細胞周期分析將收集的懸浮細胞室溫下400G離心5MIN。棄上清，加入250ΜL胰酶溶液（A液），用手指輕彈將其混勻，室溫下反應(yīng)10MIN。然后再加入200ΜL的胰酶抑制劑和核糖核酸酶的混合液（B液），用手指輕彈將其混勻，室溫下反應(yīng)10MIN。最后加入200ΜL冰冷的PI染液（C液）用手指輕彈將其混勻，4℃避光反應(yīng)10MIN。然后將其在3H內(nèi)上流式細胞儀檢測，以上實驗隨機重復(fù)3次。7細胞凋亡分析將消化的KBV細胞用PBS洗滌細胞兩次，收集1106個細胞，加入500ΜL的BINDINGBUFFER重懸細胞。加入5ΜL的ANNEXINVFITC混勻后再加入5ΜL的PROPIDIUMIODIDE，混勻室溫避光反應(yīng)515MIN。在染色后1H內(nèi)上流式細胞儀進行檢測，以上實驗隨機重復(fù)三次。8WESTERNBLOTWESTERNBLOT分析槲皮素對CASPASE3、BAX、BCL2及PGP蛋白表達的影響，然后通過GELPROANALYZERALPHAINNOTECHCPCA分析軟件，對蛋白的表達狀況進行定量分析（目的蛋白內(nèi)參蛋白）。三、實驗結(jié)果1MTT檢測槲皮素對KBV細胞生長能力的影響低濃度25ΜMOLL的槲皮素處理12H、24H和48H后，KBV細胞的生長抑制率分別為（1376±2679）％，（1463±4262）％和（1680±3876）％統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該濃度槲皮素的生長抑制效應(yīng)并未隨著時間增長而升高。槲皮素對KBV細胞的生長抑制效應(yīng)隨著槲皮素濃度的上升而增高，第48H時，75ΜMOLL槲皮素的生長抑制率為50％，因此其IC50值為75ΜMOLL。2槲皮素可抑制KBV細胞遷移和侵襲能力與對照組相比，處理組遷移侵襲比例顯著降低，25ΜMOLL，50ΜMOLL和100ΜMOLL槲皮素處理組其遷移細胞百分比分別為6014％，3040％和1393％P＜001侵襲細胞百分比分別為3857％、2227％和512％P＜001。3槲皮素對KBV細胞增殖及其細胞周期的影響50ΜMOLL槲皮素處理24H后，對照組增殖細胞百分比為槲皮素處理組的兩倍。50ΜMOLL槲皮素處理24H后，G1期細胞的比例明顯升高，由4241％升高到5266％P＜001，S期細胞的比例明顯降低，由5224％降低到4304％P＜001。4槲皮素對KBV細胞凋亡的影響與對照組相比，槲皮素處理組其凋亡細胞百分比顯著升高，且有一定的濃度依賴性，槲皮素濃度為100ΜMOLL時其凋亡細胞百分比為1753％。5槲皮素對BCL2、BAX及CASPASE3蛋白表達的影響槲皮素處理24H后，隨著槲皮素濃度的升高，抗凋亡蛋白BCL2和35KDA的CASPASE3蛋白表達量逐漸降低，而抑凋亡相關(guān)蛋白BAX和17KDA的CLEAVEDCASPASE3蛋白表達量逐漸升高，均有一定的濃度依賴性，以上數(shù)據(jù)表明槲皮素可通過線粒體途徑來誘導(dǎo)KBV細胞的凋亡。6槲皮素對耐藥相關(guān)蛋白PGLYCOPROTEIN表達的影響用0、25、50、75及100ΜMOLL槲皮素處理KBV細胞24H后，WESTERNBLOT檢測顯示PGP的表達量發(fā)生明顯改變，隨著槲皮素濃度的升高，PGP的表達量逐漸降低，有一定的濃度依賴性。與對照組相比，25、50、75及100ΜMOLL槲皮素處理KBV細胞24H后，PGP的表達量分別為91％、83％、66％和45％。7槲皮素可通過下調(diào)PGP表達來增強KBV細胞對長春新堿的敏感性與對照組和長春新堿單獨處理組相比，聯(lián)合用藥組能顯著降低PGP的表達量，而與槲皮素處理組相比卻無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。與單獨用藥組和對照組相比，聯(lián)合用藥組能顯著降低其增殖細胞百分比，并且其凋亡比例也顯著升高。與對照組和單獨處理組相比，聯(lián)合用藥組KBV細胞的遷移和侵襲細胞比率降至882％和127％以上研究進一步證明槲皮素可通過下調(diào)PGP的表達來增強KBV細胞對化療藥物長春新堿的敏感性。四、實驗結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制KBV細胞的遷移、侵襲、增殖以及與其凋亡和耐藥相關(guān)的分子信號機制，且可增強其對長春新堿的敏感性。

簡介：鉤蟲感染仍為當(dāng)今人體重要的腸道寄生蟲感染之一嚴(yán)重危害人們尤其農(nóng)民和礦工的身體健康。作者從2005年3月至2009年1月完成了以下幾個部分調(diào)查和研究以期闡明閩南城鄉(xiāng)和礦區(qū)人體鉤蟲病的流行病學(xué)特征并對鉤蟲的生物學(xué)及分子生物學(xué)進行研究為設(shè)計防治措施提供科學(xué)依據(jù)。獲得了以下主要研究結(jié)果1閩南城鄉(xiāng)人體腸道寄生蟲調(diào)查在廈門、漳州、龍巖和南平等4市調(diào)查13個點共檢查了13314人檢出鉤蟲、蛔蟲、鞭蟲和蟯蟲等腸道寄生蟲總感染率1031％感染人數(shù)分別為1070、98、33和172感染率依次為804％、074％、025％、129％構(gòu)成比分別為7791％717％242％1250％。其中發(fā)現(xiàn)廈門市同安區(qū)蓮花鎮(zhèn)美埔村鉤蟲感染率為4000％40100為鉤蟲重度流行區(qū)。證明在閩南城鄉(xiāng)人體鉤蟲感染仍較嚴(yán)重。2閩南城鄉(xiāng)及礦區(qū)人體鉤蟲流行病學(xué)特征1散發(fā)性特征調(diào)查發(fā)現(xiàn)重度和中度感染鉤蟲的病例多以散發(fā)的形式發(fā)生歸為兩類第一類為外來務(wù)工人員集中區(qū)如礦工和居住在城鄉(xiāng)接合部等種植蔬菜、水果的外來民工；第二類是少部分本地50歲以上的中、老年人。2和性別、年齡關(guān)系男、女鉤蟲感染差異顯著X24189P＜005。同時鉤蟲感染率有隨年齡的增長而升高趨勢感染年齡最小的8個月最大的89歲均為女性。各年齡組鉤蟲感染率差異顯著X275890P＜005。年齡與感染率之間的統(tǒng)計分析呈正相關(guān)年齡與感染率兩變量間高度相關(guān)回歸系數(shù)經(jīng)顯著檢驗有差異顯著R09800P＜005。50歲以上人群中中度和重度感染的比例較大分別為8816％8410％。由此可見鉤蟲對50歲以上中、老年人身體危害較大應(yīng)予特別關(guān)注。3蟲種特征261份鉤蟲蟲卵陽性糞便培養(yǎng)結(jié)果表明閩南城鄉(xiāng)系以美洲鉤蟲為主的2種人體鉤蟲即美洲鉤蟲和十二指腸鉤蟲混合感染流行區(qū)美洲鉤蟲感染占絕大多數(shù)；而來閩務(wù)工的外省籍人口包括江西四川、湖北、浙江、安徽等以十二指腸鉤蟲為主稍高于美洲鉤蟲。4和職業(yè)關(guān)系以從事種植蔬菜、水果草莓、龍眼、園林綠化、垃圾填埋職業(yè)的來廈民工鉤蟲感染率最高達到3399％。文化程度以初中感染率為最高6歲以下及大專以上最低文化程度的差異顯著X210702P＜005。A漳平煤礦礦工鉤蟲重度感染占感染者總數(shù)8333％邵武煤礦礦工鉤蟲中度、重度感染分別占感染者總數(shù)2500％833％表明鉤蟲病至今仍然是礦區(qū)流行最廣的、危害最嚴(yán)重的腸道寄生蟲病。礦區(qū)土壤污染以煤土、菜地鉤蚴居多。東孚垃圾場填埋工人以蛔蟲輕度感染為主在城市從事種植的民工以鉤蟲輕度和重度感染為主。居住時間不到1年者感染率較高2441％。B對島外某駐軍102名官兵及其家屬糞檢結(jié)果表明鉤蟲為主要的腸道寄生蟲感染占感染者總數(shù)7143％。5個廈門市常年污水監(jiān)測點發(fā)現(xiàn)攜帶寄生蟲卵多的污水分布在同安和中山醫(yī)院的污水出口處且以鉤蟲卵較多。高峰期在7月至8月可能與當(dāng)?shù)刂饕r(nóng)作物種植季節(jié)有相關(guān)性。5和民族關(guān)系在漳州市華安縣調(diào)查漢、畬2個民族表明畬族的感染率高于漢族2個民族人群鉤蟲感染率差異顯著X2504P＜005。6家庭聚集性特征對369戶二項分布齊性檢驗的G統(tǒng)計量顯示鉤蟲感染家庭聚集性分布差異顯著P＜001建議防治注重以家庭為主體的服藥。訪問415個居民寄防知識平均知曉率較低2915％。調(diào)查蔬菜被污染人體寄生蟲卵、幼蟲陽性率為1429％菜地鉤蟲、蛔蟲和鞭蟲總感染率2857％以農(nóng)村較高。3廈門市兒童蟯蟲感染現(xiàn)狀抽查7所幼兒園共625名兒童感染率為2320％6歲組最低5歲組最高各年齡組相差1周歲之間無顯著差異。男孩與女孩感染率分別為2821％和1821％差異顯著。外來民工子女蟯蟲感染率遠高于本地生源；環(huán)境蟯蟲卵以兒童內(nèi)褲污染率較高857％670。此外還報道了蛔蟲和鞭蟲感染率隨年齡增長的趨勢10～15歲年齡組達到頂峰分別為243％、093％。調(diào)查了70份狗、貓糞便中的犬鉤蟲其感染率分別為2800％1450500％120前者感染率較高兩者差異顯著X2596P＜005。同時對若干重要人體寄生蟲病例做了個案記述、感染史推測與分析。4根據(jù)形態(tài)學(xué)研究描述了圓線蟲目STRONGYLIDA的四種線蟲即美洲鉤蟲、十二指腸鉤蟲、犬鉤蟲和東方毛圓線蟲及桿形線蟲目RHABDITIDA糞類圓線蟲的形態(tài)特征。此外就蛔蟲、鞭蟲、蟯蟲、肝吸蟲蟲卵也做了形態(tài)描述。5自行設(shè)計了配套使用的一大一小的培養(yǎng)皿成功收集到大量鉤蚴其在相同的培養(yǎng)條件下獲得的幼蟲數(shù)量相當(dāng)于“T”試管濾紙培養(yǎng)法的30～40倍并且所獲的蟲體清潔不受糞便污染有利于鉤蟲的生物學(xué)研究。6首次應(yīng)用線蟲霧化分離器在分離土壤中的鉤蚴技術(shù)方面進行了探討證明其分離效率隨著時間的推移而逐步提高且始終保持較高的成活率60％可用于土源性寄生蟲流行病學(xué)大規(guī)模調(diào)查和實驗寄生蟲學(xué)研究。7用第5點方法獲得大量鉤蚴首次在沙盤中進行對鉤蚴的引誘移行試驗。①在沙盤含水率1520％的范圍內(nèi)大腸桿菌對美洲L3鉤蚴的誘引效果比無菌水的好；同時隨著含水率的提高大腸桿菌誘引到的鉤蚴增加而含無菌水的海綿條中鉤蚴減少。②在溫度2037℃的范圍內(nèi)大腸桿菌對鉤蚴的誘引效果比無菌水誘引的好；而隨著溫度的升高大腸桿菌和無菌水誘引到的鉤蚴出現(xiàn)不同程度的增加趨勢說明溫度是影響鉤蚴移行的重要因子。③大腸桿菌、人體汗液皮屑比豬小腸內(nèi)容物、無菌水對鉤蚴具有較明顯的誘引作用。8在2％的水瓊脂平板上進行大腸桿菌對鉤蚴的吸引試驗美洲鉤蟲、十二指腸鉤蟲、犬鉤蟲的鉤蚴都有向平板中心菌塊移動的趨勢三者以美洲鉤蟲L3鉤蚴吸引力占有明顯的優(yōu)勢。9分別克隆了十二指腸鉤蟲的ITS158SITS2和18SRDNA序列上傳到GENEBANK中注冊登錄號分別為58SRRNA基因EU344796、ITS158SITS2EU344797、18SRRNA基因EU344798其中18SRDNA是新的序列。根據(jù)ITS1和ITS2的序列做了鉤口屬ANCYLOSTOMA的系統(tǒng)發(fā)育分析進一步從分子水平證實了與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致即供試鉤蟲為十二指腸鉤蟲ADUODENALE。利用18SRDNA序列對圓線目STRONGYLIDA進行了系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明圓線目有3個主要進化枝CLADE其中鉤口亞目ANCYLOSTOMATINA和圓線亞目STRONGYLINA共享同一個進化枝自引支持度88％。RAPD分析結(jié)果表明十二指腸鉤蟲ADUODENALE具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性。

簡介：肺結(jié)核是長期嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病也是單因素所致感染性疾病中病死率最高的疾病之一。結(jié)核性胸膜炎作為肺外結(jié)核的類型之一約占肺結(jié)核患者的10％20％其中約10％30％的結(jié)核性胸膜炎患者臨床有胸腔積液表現(xiàn)。結(jié)核性胸腔積液作為常見的滲出性胸腔積液之一胸水TH1細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)起主導(dǎo)作用但近來研究結(jié)果表明除了TH1型免疫反應(yīng)TH2、TH9、TH17、TH22等免疫細胞亞群及協(xié)同刺激分子在結(jié)核性胸腔積液的發(fā)生、發(fā)展中亦具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)協(xié)同刺激分子PDL1PROGRAMMEDDEATH1LIG1程序性死亡配體1又名B7H1在激活的T淋巴細胞、B淋巴細胞及單核巨噬細胞等多種免疫細胞表面表達增高并與機體的免疫抑制相關(guān)。業(yè)已證明肺結(jié)核患者外周血中PD1、PDL1表達顯著增高可能與結(jié)核病免疫耐受及慢性化炎癥相關(guān)。許多協(xié)同刺激分子如OX40、OX40LOX40配體、B7H3和CTLA4細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4等除膜型外還以可溶性的形式存在。既往對肺癌患者外周血可溶性PDL1SPDL1檢測發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清SPDL1表達異常增高并與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和療效相關(guān)。而胸腔積液中是否存在SPDL1及SPDL1在結(jié)核性胸腔積液中的生物學(xué)意義的研究并不多見。本研究中我們采用蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所自主研發(fā)的特異性人SPDL1的酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測體系對結(jié)核性胸腔積液患者開展深入研究檢測結(jié)核性胸腔積液中SPDL1的表達分析其臨床指導(dǎo)意義揭示SPDL1和PD1PDL1協(xié)同刺激信號與結(jié)核性胸腔積液疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系進一步探究SPDL1在結(jié)核性胸腔積液中的生物學(xué)意義。為免疫學(xué)方法在結(jié)核性胸腔積液中的治療提供依據(jù)。一、可溶性PDL1在結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液和外周血中的表達水平及臨床意義【目的】檢測結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液和外周血中可溶性PDL1的表達水平并探討其臨床意義。【方法】篩選2012年6月至2013年3月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸科收治的初診胸腔積液患者68例其中結(jié)核性胸腔積液組共24例惡性胸腔積液組共30例非結(jié)核、非惡性胸腔積液組14例。收集上述人群胸腔積液和外周血清并記錄其臨床資料。采用酶聯(lián)免疫吸附方法ELISA檢測胸腔積液和外周血中SPDL1的水平。流式細胞法FCM檢測胸腔積液和外周血中CD4T細胞的表達、CD8T細胞的表達、PD1在CD4T細胞上的表達CD4PD1、PD1在CD8T細胞上的表達CD8PD1、CD14單核細胞和PDL1在CD14單核細胞上的表達CD14PDL1。反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測胸腔積液中PDL1、基質(zhì)金屬蛋白酶3MMP3基因表達。受試者工作特征ROC曲線分析SPDL1對結(jié)核性胸腔積液的診斷價值?！窘Y(jié)果】結(jié)核性胸腔積液中SPDL1含量顯著高于惡性組和非結(jié)核、非惡性組P【結(jié)論】SPDL1反映了不同病因胸腔積液微環(huán)境中不同的免疫功能狀態(tài)結(jié)核性胸腔積液中SPDL1表達明顯增高可能與結(jié)核性胸腔積液的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)胸水中SPDL1檢測有助于結(jié)核性胸腔積液的鑒別診斷。二、結(jié)核性胸腔積液中IFNΓ和IFNΑ的表達及PD1PDL1協(xié)同刺激信號在結(jié)核性胸膜炎中的免疫學(xué)作用【目的】檢測結(jié)核性胸腔積液中IFNΓ和IFNΑ的表達水平并分析其臨床意義探討PD1PDL1協(xié)同刺激信號在結(jié)核性胸膜炎中的免疫學(xué)作用。【方法】收集上述68例胸腔積液患者胸腔積液標(biāo)本采用ELISA法檢測胸腔積液中IFNΓ和IFNΑ的表達水平。分離健康成人外周血單個核細胞PBMCS以不同濃度結(jié)核性胸腔積液刺激培養(yǎng)后采用流式細胞術(shù)FCM檢測PBMCS細胞表面PDL1的表達變化CCK8摻入法檢測PBMCS增殖的改變。免疫磁珠法分選結(jié)核性胸腔積液中T淋巴細胞和CD14單核細胞CCK8摻入法檢測共培養(yǎng)體系中T細胞增殖的改變?！窘Y(jié)果】結(jié)核性胸腔積液組中IFNΓ含量顯著高于惡性組和非結(jié)核、非惡性組P005。胸腔積液中SPDL1表達與TH1型主要細胞因子IFNΓ及胸腔積液腺苷脫氨酶ADA表達成正相關(guān)P00004P【結(jié)論】結(jié)核性胸腔積液中IFNΓ表達增高與胸腔積液中SPDL1表達成正相關(guān)聯(lián)合IFNΓ及各臨床指標(biāo)檢測有助于結(jié)核性胸腔積液的鑒別診斷高表達的TH1型細胞因子IFNΓ可能與PD1PDL1協(xié)同刺激信號在結(jié)核性胸膜炎中的免疫作用相關(guān)。綜上所述本課題研究獲得了以下研究結(jié)果1結(jié)核性胸腔積液中SPDL1、TH1型細胞因子IFNΓ、CD8細胞表達和PDL1在CD14單核細胞表達增高SPDL1單因素檢測或聯(lián)合各臨床指標(biāo)有助于結(jié)核性胸腔積液的診斷。2結(jié)核性胸腔積液可體外促進CD14單核細胞表面PDL1的表達及外周血單個核細胞的增殖增高表達的PDL1與T細胞表面PD1受體相結(jié)合抑制了機體的免疫效應(yīng)可能與結(jié)核性胸腔積液的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。3通過抗PDL1單抗阻斷PD1PDL1途徑可部分恢復(fù)T淋巴細胞增殖能力為結(jié)核性胸腔積液的免疫治療提供了依據(jù)。

簡介：目的利用人胚胎干細胞具有多向分化潛能的特性，使用小分子化合物特異性作用于調(diào)節(jié)表皮外胚層及角膜上皮細胞分化發(fā)育過程中重要信號通路的某些調(diào)控位點，結(jié)合ΒFGF，誘導(dǎo)人胚胎干細胞向角膜上皮樣細胞方向分化，以獲得角膜上皮樣細胞。方法懸滴法培養(yǎng)人胚胎干細胞，獲得具有向三個胚層分化潛能的擬胚體EMBRYONICBODIES，EBS。將獲得的擬胚體于3D培養(yǎng)體系中懸浮培養(yǎng)，利用小分子化合結(jié)合ΒFGF，誘導(dǎo)擬胚體逐步向外胚層、表皮外胚層、角膜上皮樣細胞方向分化。懸浮培養(yǎng)4天后轉(zhuǎn)為貼壁培養(yǎng)，利用貼壁誘導(dǎo)培養(yǎng)條件及不同種類誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進一步誘導(dǎo)細胞向角膜上皮樣細胞方向分化。分別于誘導(dǎo)第10、20、30天取材，從基因水平、細胞水平檢測OCT4、P63、PAX6、K12、K14表達水平，判斷各組分化程度及分化效率。結(jié)果小分子化合物可下調(diào)干細胞標(biāo)記物表達水平，上調(diào)角膜上皮樣細胞相關(guān)標(biāo)記物表達水平小分子化合物可誘導(dǎo)人胚胎干細胞向角膜上皮樣細胞方向分化小分子化合物結(jié)合不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基在不同誘導(dǎo)階段調(diào)控基因表達水平效率不同。結(jié)論小分子化合物聯(lián)合ΒFGF，通過特異性阻斷WNT、TGFΒ信號通路，可誘導(dǎo)人胚胎干細胞向角膜上皮樣細胞方向分化。在誘導(dǎo)分化過程中，干細胞標(biāo)記基因表達水平下調(diào)，角膜上皮細胞發(fā)育調(diào)控基因及角膜上皮細胞特征性標(biāo)記基因表達水平上調(diào)。與基礎(chǔ)培養(yǎng)基組（陰性對照組）、基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基組（陽性對照組）、誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基組（陽性對照組）相比，小分子化合物誘導(dǎo)上述基因表達上調(diào)時間出現(xiàn)早，且上調(diào)水平明顯高于其他三組。同時，小分子化合物結(jié)合不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基、在誘導(dǎo)分化不同階段的誘導(dǎo)分化效率存在差異。若為短期（1020天）誘導(dǎo)，小分子化合物SHEM、小分子化合物UM組誘導(dǎo)效率高若誘導(dǎo)周期長30天以上，則以小分子化合物KSFM、小分子化合物DKSFM組誘導(dǎo)效率高。

簡介：181工774河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)及知識產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本學(xué)位論文在導(dǎo)師或指導(dǎo)小組的指導(dǎo)下，由本人獨J、’，完成。本學(xué)位論文研究所獲的研究成果，其知識產(chǎn)權(quán)歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。河北醫(yī)科大學(xué)有權(quán)對本學(xué)位論文進行交流、公開和使用。兒發(fā)表與學(xué)位論文主要內(nèi)容相關(guān)的論文，第一署名單位為河北醫(yī)科大學(xué)，試驗材料、原始數(shù)據(jù)、申報的專利等知識產(chǎn)權(quán)均歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。否則，承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。研究生之名私榭舉P師簽章勞扣鬈』級學(xué)院毒‘。。。≯20FO年F月糾’日．河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注等內(nèi)容外，文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，指導(dǎo)教師對此進行了審定。本論文由本人獨立撰寫，文責(zé)自負。研究生簽名新椰體導(dǎo)師簽章肇矽釤導(dǎo)師簽章所∥Y2OFO年廠月2／日L目錄中文摘要?????????????????????????1英文摘要?????????????????????????3研究論文致病性地霉的分子生物學(xué)鑒定前言?????????????????????????66月U舌?????????????????????????材料與方法??????????????????????6結(jié)果?????????????????????????12附圖?????????????????????????14討論?????????????????????????19結(jié)論?????????????????????????24參考文獻???????????????????????25綜述念珠菌性陰道炎的研究進展??????????????28致謝???????????????????????????44個人簡歷?????????????????????????45