簡(jiǎn)介：山西大學(xué)碩士學(xué)位論文兩株產(chǎn)海因酶菌株的分子生物學(xué)及理化性質(zhì)的比較姓名趙莉霞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師袁靜明李卓玉20030601兩株產(chǎn)海因酶菌株的分子生物學(xué)及理化性質(zhì)的比較ABSTRACTDAMINOACIDSARCWIDELYUSEDINSEVERALFIELDSSUCHASPHARMACEUTICS．FOODADDITIVES．PESTICIDESANDCOSMETICSETC．DAMINOACIDSAREUSUALLYPRODUCEDBYENZYMATICORCHEMOENZYMATICMETHOD．INBIOCONVERSIONOFADAMINOACIDANDITSDERIVATIVE．THESUBSTRATE，5’MONOSUBSTIMTEDHYDANTOINISFIRSTLYTRANSFERREDINTOALLINTERMEDIATE．DCARBAMYLAMINOACIDBYDHYDANTOINASE，ANDINTURNINTOANOPTICALLYACTIVEDAMINOACIDBYEITHERDCARBAMOYLASEORCHEMICAL，NAN02NOWADAYS，THEBIOCONVERSIONOFD．AMINOACIDSHASBEENINDUSTRIALIZEDBYENZYMES．SOCALLEDONESTEDPROCESS．HOWEVER,THEYIELDOFDAMINOACIDSHASBEENTEMPEREDBYSOMELIMITEDFACTORSFROMSTRAINPERSERESULTINGINTHESHORTAGESOFTHATGOODSINTHEMARKETS．THEREFORE，SCIENTISTSARCTRYILLGTOSUBSTITUTEENGINEEREDSTRAINSFORNATURALSTRAINSINTHEPROCESSDESCRIBEDABOVE．DURINGCLONINGHYDANTOINASEGENEFROMTHEORIGINALSTRAINSS．ORI，WEOCCASIONALLYPICKEDUPACOLONYYZ．T16WHICHOCCURREDAHIGHHYDANTOINASEACTIVITY．ASERIESOFEXPERIMENTSWEREPERFORMEDTOCONFIRMWHETHERTHISSWAINWASTHESILRFIEASTHEORIGINALONE．1．THEHEREDITYOFSTRAINYZ116ISQUITESTABLEBECAUSETHEREISNOANYCHANGEFORHYDANTONIASEACTIVITY,EVENAFTERPASSINGTHEGENERATIONSFOR8TIMES．2．THESTRAINCANGROWONYCGMEDIUMSUPPLEMENTEDWITHAMP，UPTOTHECONCENTRATIONOF400UG／ML，WHILSTTHEORIGINALONECANNOTGROWONTHESAMEMEDIUMEVENAT50UG／MLOFAMP．3．ITSSHOWNFROMTHERESULTSOFDNADIGESTION．HYDANTOINASEGENEAMPLIFICATION，RAPD，E砒CPCRETC，THATTHEELECTROPHORETICPATTERNSOFTHEPRODUCTSAREOBVIOUSLYDIFFERENTFORMTHEORIGINALONE．4．COMPAREDWITHENZYMATICACTIVITY,HYDANTOINASEACTIVITY0．72U／MLLFORYZ116ISHIGHERTHANTHATOFSS．ORIO．20U／ML．ONTHECONTRARY,DCARBAMOYLASEACTIVITYOF血EFORMERFO．04U／MLISOBVIOUSLYLOWERTHANTHATOFTHELARERO．45U／ML．5．THEMORPHOLOGYOFTHETWOSTRAINSALSOSHOWSTHATTHEFLAGELLAOFSSORIAREAROUNDTHECELLS．WHILSTTHESTRAINYZ116HASONLYASINGLEFLAGELLUMGROWNATTHEPOLAROFCELLSBESIDESTHEDIFFERENTOFCELLSIZE，THOUGHTHEYBOTHAREBACILLUSANDGRAMNEGATIVE．6．ITISALSOINDICATEDFROMTHERESULTSOFPHYSICOCHEMICALPROPERTIESTHATOXIDASEANDCATALASEREACTIONAREBOTHPOSITIVEANDTHETESTFORGLNCOSEOXIDATIONISTHESAMEKINDOFACID．PRODUCINGTYPEFORBOTHSTRAINS．WECONSIDERFROMTHEABOVEDATATHATYZ116COULDBELONGTOPSEUDOMONASSP．ANDSSORITOAGROBACTERIASP．．FINALLY，INVIEWOF16SRDNASEQUENCEANALYSIS，STRAINYZ116ISCLASSIFIEDTOPSEUDOMONASSP．ANDSTRAINSS．ORIISSINORHIZOBIUMSP．ACCORDINGTOTHE“BLAST’DATA．．2．

簡(jiǎn)介：華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文LRIG3對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系GL15生物學(xué)特性影響的分子生物學(xué)機(jī)制研究姓名席桂發(fā)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)外科學(xué)（神經(jīng)外科）指導(dǎo)教師雷霆20070501華華中中科科技技大大學(xué)學(xué)博博士士學(xué)學(xué)位位論論文物學(xué)特性的影響。方法方法甲基四唑蘭MTT和TRANSWELL分別檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子EGFAG1478對(duì)GL15細(xì)胞增殖和侵襲力的影響，逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR和WESTERNBLOT分別檢測(cè)EGF和AG1478作用后GL15細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAPMRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果結(jié)果外源性的EGF雙向調(diào)節(jié)GL15細(xì)胞增生和生長(zhǎng)，小劑量（50NGML，100NGML）EGF能促進(jìn)細(xì)胞增生和提高細(xì)胞侵襲能力以及GFAMINRNA和蛋白表達(dá)，而大劑量（200NGML）則能降低其增殖和侵襲能力，AG1478則能明顯拮抗EGFR活性。結(jié)論結(jié)論GL15膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的生物學(xué)特性與EGFR所在的7號(hào)染色體過(guò)度擴(kuò)增密切相關(guān)。EGF可雙向調(diào)節(jié)GL15細(xì)胞系的生長(zhǎng)，AG1478能不完全抑制EGFR的活性。EGFR是基因治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的理想靶點(diǎn)。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞表皮生長(zhǎng)因子受體；GL15細(xì)胞；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；膠質(zhì)纖維酸性蛋白第三部分第三部分LRIG3調(diào)控調(diào)控GL15細(xì)胞生物學(xué)活性的分子機(jī)制的研究細(xì)胞生物學(xué)活性的分子機(jī)制的研究目的目的探討LRIG3調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系GL15生物學(xué)行為的分子機(jī)制。方法方法用LRIG3EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GL15細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化，MTT法和TRANSWELL分析檢測(cè)EGF和AG1478對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖和侵襲的影響，逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR和WESTERNBLOT分別檢測(cè)EGF作用于轉(zhuǎn)染后的GL15細(xì)胞EGFR和LRIG3蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果結(jié)果將質(zhì)粒LRIG3EGFP轉(zhuǎn)染GL15細(xì)胞后，LRIG3主要在胞漿表達(dá)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞其細(xì)胞周期多阻滯在S期，細(xì)胞侵襲性明顯下降。用100NGMLEGF分別作用于各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞后，不同的時(shí)間點(diǎn)其EGFR和LRIG3表達(dá)不同，隨時(shí)間延長(zhǎng)，EGFR的表達(dá)下降，LRIG3表達(dá)增加。結(jié)論結(jié)論過(guò)表達(dá)LRIG3EGFP可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并使其侵襲性下降，這種抑制作用與EGFR的活性密切相關(guān)。LRIG3可能是基因治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤重要的靶基因。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞LRIG3；表皮生長(zhǎng)因子；GL15細(xì)胞；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤4

簡(jiǎn)介：L8S6L79ATHESISDISSERTATIONSUBMITTEDTOZHENGZHOUUNIVERSITYFORTHEDEGREEOFMASTERTHEMOLECULARBIOLOGICALANALYSISONALARGECHINESEPEDIGREEOFLEBERHEREDITARYOPTICNEUROPATHYONLYWITHMALEPATIENTSBYSHIXIAOLINGSUPERVISORPROFJINXUEMINOPHTHALMOLOGY一一一THEFIRSTAFFILIATEDHOSPITALOFZHENGZHOUUNIVERSITYMAY2010目的分析一未攜帶原發(fā)突變且僅有男性患者的LEBER遺傳性視神經(jīng)病變家系的臨床表型、遺傳特征，檢測(cè)其突變基因，探討是否與X染色體有關(guān)。方法收集河南安陽(yáng)一僅有男性患者且臨床診斷為L(zhǎng)HON家系的臨床資料，分析遺傳特征；用PRIMER5設(shè)計(jì)線粒體引物，PCRPOLYMERASECHAINREACTION一測(cè)序重新檢測(cè)該家系是否攜帶3個(gè)原發(fā)突變。對(duì)先證者線粒體基因MITOEHONDRIALDNA，MTDNA全測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與修正的MTDNA劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，確定該家系的突變位點(diǎn)，然后在專業(yè)遺傳學(xué)網(wǎng)站上查找這些突變位點(diǎn)的相關(guān)信息，必要時(shí)進(jìn)行對(duì)照人群MTDNA測(cè)序分析，以確定致病突變；在ABIPRISM⑩LINKAGEMAPPINGSETVERSION25試劑盒中挑選可以覆蓋整條X染色體的18個(gè)微衛(wèi)星熒光標(biāo)記對(duì)家系內(nèi)成員進(jìn)行X染色體掃描，GENOTYPER37軟件進(jìn)行基因分型，LINKAGE和M甜IN112軟件進(jìn)行連鎖分析，初步定位可能存在X連鎖修飾基因的區(qū)域，進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)掃描和定位，最后利用CYRILLIE軟件構(gòu)建單倍體型圖，確定是否存在X染色體連鎖修飾基因。結(jié)果此家系符合母系遺傳特征，30位母系成員中6人發(fā)病，且全部為男性，表現(xiàn)出低外顯率和男性患病偏倚的特點(diǎn)。重新測(cè)序發(fā)現(xiàn)該家系未攜帶3個(gè)原發(fā)突變。先證者M(jìn)TDNA全測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)31個(gè)同質(zhì)突變位點(diǎn)，其中包括1個(gè)已報(bào)道的致病突變位點(diǎn)G3635A和2個(gè)未報(bào)道過(guò)的突變點(diǎn)ND4T11809C與ND5A12340G。T11809C為無(wú)義突變，A12340G為錯(cuò)義突變，剩余28個(gè)突變點(diǎn)均為已報(bào)道過(guò)的線粒體多態(tài)，該先證者屬于線粒體單倍體型F1。MTDNA測(cè)序所有其它母系成員均同時(shí)攜帶G3635A和A12340G突變。107位正常家系外對(duì)照中不存在G3635A和A12340G突變。連鎖分析在DXSL060得到最大兩點(diǎn)LOD值146A0O，但是兩點(diǎn)非參數(shù)分析和多點(diǎn)非參數(shù)分析結(jié)果顯示所有標(biāo)記P005，單倍體型分析圖未發(fā)現(xiàn)共分離單倍體。結(jié)論此家系為攜帶G3635A和A12340G突變的LHON家系；此家系不存在X連鎖修飾基因。關(guān)鍵詞LEBER遺傳性視神經(jīng)病變；線粒體DNA；突變；X染色體連鎖修飾基因；連鎖分析

簡(jiǎn)介：金納米粒子具有許多優(yōu)良的理化特性，因而在醫(yī)學(xué)成像、疾病診斷、藥物載體、腫瘤治療和基因診療等生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。由于目前還未形成對(duì)納米材料安全性評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)體系，納米材料的安全性問(wèn)題越來(lái)越得到各界的重視。為了使納米材料能更安全有效的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，關(guān)于它們對(duì)細(xì)胞以及機(jī)體的健康和生物學(xué)功能的影響以及作用機(jī)理的研究也就顯得越來(lái)越重要。目前，關(guān)于金納米顆粒分子生物相容性的相關(guān)研究還很少。本論文的研究目的是在金納米顆粒與細(xì)胞相互作用的檢測(cè)基礎(chǔ)上，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析，從蛋白質(zhì)水平上對(duì)20NM金納米粒子對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HDFF）的分子生物相容性進(jìn)行機(jī)理研究。通過(guò)探索研究納米材料與機(jī)體相互作用的機(jī)理的新途徑，為建立基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的納米材料分子生物相容性評(píng)價(jià)的新方法打下基礎(chǔ)。本論文的具體工作如下1、采用檸檬酸鈉還原氯金酸法摸索并制備了20NM納米金溶膠。采用紫外分光光度計(jì)和透射電鏡對(duì)制備的納米金溶膠進(jìn)行表征。此外，對(duì)不同水溶劑制備納米金溶膠結(jié)果進(jìn)行了初步探討，并對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的納米金溶膠尺寸選擇進(jìn)行了調(diào)研。2、采用MTT實(shí)驗(yàn)獲得了HDFF細(xì)胞活力代謝標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)制備不同濃度的20NM納米金溶液，首先應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了10300ΜM納米金處理細(xì)胞72H的細(xì)胞毒性，并考察了特定濃度（200ΜM）的納米金作用細(xì)胞1、4、8H后的細(xì)胞毒性；然后采用流式細(xì)胞儀技術(shù)研究了200ΜM，20NM納米金處理細(xì)胞1、4、8H后對(duì)細(xì)胞周期和后期凋亡的影響。MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀的結(jié)果顯示，200ΜM，20NM納米金對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。3、應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（二維差異凝膠電泳（2DDIGE）實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜（MASSSPECTROMETRY）實(shí)驗(yàn)）考察了200ΜM納米金，作用1、4、8H后的細(xì)胞發(fā)生差異表達(dá)的蛋白情況。采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WESTERNBLOT）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中挑選的兩個(gè)蛋白進(jìn)行了初步驗(yàn)證。通過(guò)采用ONEWAYANOVA差異點(diǎn)篩選原則，獲得了細(xì)胞在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)都發(fā)生差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)40個(gè)。應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)2DDIGE獲得的40差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，最終鑒定出36個(gè)蛋白點(diǎn)，按照功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行分類，其中有功能蛋白29個(gè)，結(jié)構(gòu)蛋白7個(gè)。29個(gè)功能蛋白分別屬于23種不同蛋白。WESTERNBLOT結(jié)果顯示，兩個(gè)蛋白表達(dá)情況與2DDIGE結(jié)果一致。4、應(yīng)用CLUSTER和TREEVIEW軟件對(duì)200ΜM，20NM納米金作用HDFF1、4、8H后三個(gè)實(shí)驗(yàn)組發(fā)生的40個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行層次聚類分析，對(duì)蛋白表達(dá)模式隨時(shí)間變化的規(guī)律進(jìn)行分類和研究。所有差異表達(dá)蛋白在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)都上調(diào)表達(dá)的有9個(gè)；都下調(diào)表達(dá)的13個(gè)；既有上調(diào)又有下調(diào)表達(dá)的18個(gè)。所有差異表達(dá)蛋白的可分為8種表達(dá)模式。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜鑒定出的相同或功能相似蛋白，大部分都聚類在同一表達(dá)模式中。5、應(yīng)用GOSURFER。軟件對(duì)200ΜM，20NM納米金作用HDFF1、4、8H后三個(gè)實(shí)驗(yàn)組發(fā)生差異表達(dá)的23種功能蛋白進(jìn)行GO功能分類分析，對(duì)差異表達(dá)的蛋白按照生物學(xué)過(guò)程（BIOLOGICALPROCESS）、分子功能（MOLECULARFUNCTION）、細(xì)胞組分（CELLULARCOMPONENT）結(jié)構(gòu)層級(jí)進(jìn)行功能分類研究。根據(jù)對(duì)所有差異表達(dá)的功能蛋白進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程分類研究，發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白富集的生物學(xué)過(guò)程主要涉及細(xì)胞過(guò)程和生理過(guò)程；分子功能主要涉及結(jié)合和催化活性；細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞和細(xì)胞器。通過(guò)GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白涉及的生物學(xué)功能廣泛，這提示納米金可能對(duì)細(xì)胞有廣泛作用。6、應(yīng)用GENMAPP生物學(xué)途徑分析軟件和INGENUITYPATHWAYANALYSIS（IPA）分析平臺(tái)對(duì)200ΜM，20NM納米金作用HDFF1、4、8H后三個(gè)實(shí)驗(yàn)組發(fā)生差異表達(dá)的23種功能蛋白參與的生物學(xué)途徑和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。GENMAPP分析結(jié)果顯示23種差異蛋白共涉及21個(gè)MAPPS；對(duì)其中17個(gè)“HSCONTRIBUTEDMAPPS”涉及的生物學(xué)途徑進(jìn)行了詳細(xì)討論。IPA分析結(jié)果顯示差異功能蛋白共涉及得到7個(gè)蛋白／基因相互作用網(wǎng)絡(luò)、56個(gè)生物學(xué)功能與疾病分類和27個(gè)規(guī)范生物學(xué)途徑，并對(duì)7個(gè)蛋白／基因相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了詳細(xì)討論。通過(guò)綜合GENMAPP分析和IPA分析的結(jié)果，對(duì)納米金分子生物相容性機(jī)理進(jìn)行了初步分析。

簡(jiǎn)介：在維生素C兩步發(fā)酵工藝中，第一步為醇糖轉(zhuǎn)化，即在葡糖桿菌作用下D山梨醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)山梨糖；第二步為糖酸轉(zhuǎn)化，在普通生酮基古龍酸菌KETOGULONIGENIUMVULGARE，俗稱小菌與其伴生菌俗稱大菌組成的混合菌系的作用下L山梨糖轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2酮基L古龍酸KGA。維生素C兩步發(fā)酵實(shí)質(zhì)上就是D山梨醇和L山梨糖的專一性生物氧化過(guò)程。闡明這一系列生物氧化過(guò)程的生化反應(yīng)機(jī)制對(duì)于指導(dǎo)維生素C的遺傳育種甚至通過(guò)代謝工程構(gòu)建由山梨醇到KGA的一步發(fā)酵工程菌，都具有重要意義。本課題組已從小菌細(xì)胞裂解物中分離得到了催化山梨糖生物氧化的一種關(guān)鍵酶山梨糖脫氫酶SDH，該酶能夠?qū)山梨糖直接轉(zhuǎn)化為KGA；同時(shí)構(gòu)建了小菌的基因文庫(kù)，并以SDH的抗體篩選文庫(kù)，分離得到編碼SDH的基因SDH。本文在上述工作基礎(chǔ)上，首先在大腸桿菌中對(duì)山梨糖脫氫酶進(jìn)行了高效表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，研究了該酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)PH值、酶穩(wěn)定性、米氏反應(yīng)常數(shù)、酶的激活劑和抑制劑、金屬離子的激活與抑制作用等重要性質(zhì)。研究葡糖桿菌對(duì)山梨糖脫氫酶的影響。以氨甲?；富騂YUC為報(bào)告基因，構(gòu)建了山梨糖脫氫酶氨甲?；溉诤媳磉_(dá)載體，在大腸桿菌中可以同時(shí)檢測(cè)到山梨糖脫氫酶和氨甲?；富钚裕欢谄咸菞U菌中，只能檢測(cè)到氨甲酰化酶活性，未檢測(cè)到山梨糖脫氫酶活性。質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和質(zhì)粒回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明該質(zhì)粒在葡糖桿菌中穩(wěn)定存在。由于HYUC基因位于SDH基因下游，融合基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是從山梨糖脫氫酶到氨甲?；?，氨甲?；冈谄咸菞U菌中表達(dá)說(shuō)明包含山梨糖脫氫酶在內(nèi)的融合蛋白能夠在葡糖桿菌中轉(zhuǎn)錄并翻譯，山梨糖脫氫酶可能被宿主的酶系降解失活。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)葡糖桿菌裂解物對(duì)山梨糖脫氫酶具有降解作用。將山梨糖脫氫酶與葡糖桿菌裂解液保溫過(guò)夜后，通過(guò)SDSPAGE檢測(cè)到電泳圖譜上約60KD和49KD處出現(xiàn)兩條明顯條帶，對(duì)這兩條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)N端序列分析，結(jié)果顯示其N端的前3個(gè)氨基酸殘基均為谷氨酰胺蘇氨酸丙氨酸，推測(cè)49KD的蛋白條帶是由60KD山梨糖脫氫酶蛋白C端降解產(chǎn)生。對(duì)預(yù)測(cè)的SDH讀框N端蛋氨酸至谷氨酰胺之間23肽氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)23個(gè)氨基酸中大部分氨基酸為疏水氨基酸，并與醇脫氫酶的信號(hào)肽序列有38％的同源性，推測(cè)山梨糖脫氫酶N端的23肽可能是一段信號(hào)肽，與該酶在細(xì)胞膜上的定位相關(guān)。本文成功建立了葡糖桿菌TN5誘變系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了MINITN5轉(zhuǎn)座對(duì)葡糖桿菌的誘變，并從1032株突變株中篩選得到能夠利用山梨醇而不能利用山梨糖的突變株，為葡糖桿菌山梨醇代謝途徑研究及相關(guān)基因分離奠定了基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：隨著能源危機(jī)的日益加劇，化石燃料日益減少，國(guó)際原油價(jià)格不斷上漲。以纖維質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇是目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。其研究關(guān)鍵之一就是選育一株能有效利用各種糖底物，且高效產(chǎn)生乙醇的微生物菌種。本論文以此為研究點(diǎn)，采用代謝工程育種策略，以篩選得到的野生型熱帶假絲酵母為研究對(duì)象，通過(guò)改變其代謝流來(lái)達(dá)到提高乙醇產(chǎn)量的目的。從256個(gè)自然樣品中篩選得到1株可高效轉(zhuǎn)化D木糖的酵母441281。根據(jù)常規(guī)形態(tài)鑒別，生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定，以及ITS區(qū)域核酸序列同源性比較分析，證實(shí)該菌株屬于CIDATROPICALIS熱帶假絲酵母，其ITS序列在GENBANK的登記號(hào)為EU121523，CIDATROPICALIS熱帶假絲酵母已保存于中國(guó)高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺(tái)，保藏編號(hào)為CICIMY0092。以篩選出來(lái)的熱帶假絲酵母為研究對(duì)象，通過(guò)代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)該酵母木糖代謝的主要產(chǎn)物為木糖醇，葡萄糖代謝的主要產(chǎn)物為乙醇。通過(guò)分析酵母的代謝途徑并測(cè)定木糖代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶的比酶活力后，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確定了代謝工程育種策略為通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)木糖醇脫氫酶的表達(dá)量，來(lái)減少木糖醇的積累，試圖將代謝流引向乙醇形成方向，以達(dá)到提高乙醇產(chǎn)量的目的。以本實(shí)驗(yàn)室先期構(gòu)建的PXY212XYL2質(zhì)粒為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建了含有潮霉素抗性的質(zhì)粒PYX212XYL2HYGRO該質(zhì)粒用于整合表達(dá)時(shí)，需先用限制性內(nèi)切酶NOTI先將其線性化，電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母，潮霉素抗性平板上篩選得到轉(zhuǎn)化子。提取整合表達(dá)的重組菌染色體進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到17KB的樹干畢赤酵母XYL2基因，說(shuō)明該基因已整合到酵母染色體上。酶活測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)游離表達(dá)的重組菌的比酶活力達(dá)到05UMG，比原始菌株提高了3倍；而整合表達(dá)的重組菌的比酶活力僅提高了15％，提高幅度有限。木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，游離表達(dá)的重組菌株與原始菌株相比，木糖醇得率降低了3倍，乙醇得率提高了5倍；整合表達(dá)的重組菌株與原始菌株相比，乙醇得率沒有發(fā)生明顯的變化，但木糖醇積累量有所降低，這與目的基因表達(dá)量有關(guān)。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，提高木糖醇脫氫酶的表達(dá)量，有助于減少中間代謝產(chǎn)物木糖醇的積累，提高乙醇得率。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了熱帶假絲酵母利用木糖產(chǎn)乙醇的可行性，這對(duì)研究酵母利用纖維質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇具有重要啟示。

簡(jiǎn)介：糖作為人體能量的載體和重要的生物信息分子在許多重要的生理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用并且可以通過(guò)與蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別控制生物信息的傳遞。研究發(fā)現(xiàn)了乳糖半乳糖與只存在于哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞表面的乳糖半乳糖受體特異性的識(shí)別和結(jié)合的特性。利用該特性制備含有乳糖半乳糖的聚合物給藥載體實(shí)現(xiàn)肝臟的主動(dòng)靶向給藥越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注。脂肪族聚酯如聚乳酸以其良好的生物相容性、生物降解性、低免疫原性、可加工性和機(jī)械強(qiáng)度成為當(dāng)今應(yīng)用最廣泛的生物醫(yī)用材料之一已經(jīng)被用于藥物控制釋放體系的載體、手術(shù)縫合線和組織工程支架材料。盡管如此聚乳酸在應(yīng)用過(guò)程中仍然存在以下問(wèn)題1由于與細(xì)胞缺少足夠的相容性植入體內(nèi)后可能導(dǎo)致發(fā)炎及免疫反應(yīng)；2由于缺少官能團(tuán)很難進(jìn)行化學(xué)修飾；3親水性差。針對(duì)這些問(wèn)題本文用親水性極好、無(wú)毒、無(wú)免疫原性的聚乙二醇改善其親水性和生物相容性；通過(guò)與氨基酸NCA單體或者功能化的碳酸脂六元環(huán)單體共聚一方面改善材料的生物相容性、生物降解性和理化性質(zhì)另一方面在聚合物鏈上引入了活性官能團(tuán)并通過(guò)這些官能團(tuán)將乳糖分子以及抗癌藥物分子引入到聚合物的體系中通過(guò)納米自組裝技術(shù)制備肝靶向的高分子鍵合藥并深入的研究了該類型藥物載體在生物學(xué)上的應(yīng)用。具體研究?jī)?nèi)容如下1合成了帶有巰基的乳糖糖苷和聚乳酸聚半胱氨酸PLLAPLC并利用巰基將乳糖分子引入到聚合物的親水段得到了含糖聚合物PLLAPLC／LACTOSE通過(guò)核磁共振1HNMR、紅外光譜FTIR等手段對(duì)聚合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。接觸角實(shí)驗(yàn)證明了接枝乳糖后材料的親水性得到了改善；體外細(xì)胞培養(yǎng)證明了聚合物具有良好的生物相容性；激光共聚焦顯微鏡CLSM和表面等離子體共振SPR技術(shù)證明了合成的含乳糖材料對(duì)蓖麻凝集素RCA具有特異性識(shí)別和結(jié)合的作用。納米自組裝技術(shù)制備了膠束通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡ESEM、動(dòng)態(tài)光散射DLS、熒光光譜等方法測(cè)定了含糖聚合物膠束的表面形貌、粒徑大小及分布、臨界膠束濃度等各項(xiàng)性質(zhì)。2合成了帶有疊氮基的乳糖和帶有叁鍵的雙親性高分子PEGPMPCPLA并通過(guò)“CLICK”反應(yīng)將乳糖引入到聚合物的疏水段得到含糖聚合物PEGPMPC／LACTOSEPLA體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)證明了材料良好的生物相容性；合成含羥基的雙嵌段共聚物PEGPLADHP通過(guò)羥基將抗癌藥物引入到聚合物的疏水段得到鍵合藥物高分子PEGPLADHP／DOX。通過(guò)納米自組裝技術(shù)將兩種聚合物分子按一定比例混合制備了含糖載藥混合納米膠束通過(guò)ESEM、DLS等方法測(cè)定了含糖聚合物膠束的表面形貌、粒徑大小及分布等；激光共聚焦顯微鏡觀察了肝癌細(xì)胞對(duì)含糖膠束的特異性吞噬證明了乳糖受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用；MTT法考察了該靶向鍵合藥物膠束的細(xì)胞毒性。3合成了氨基化的雙嵌段共聚物NH2PEGPLLA并通過(guò)氨基將乳糖引入到聚合物的親水端考察了該含糖材料與蓖麻凝集素特異性結(jié)合的作用；通過(guò)聚合物PEGPLADHP的羥基引入了熒光標(biāo)記物／模式藥物羅丹明B；考察了兩種材料的生物相容性；將兩種聚合物材料按照一定的比例混合制備了多功能混合納米膠束通過(guò)ESEM、DLS、熒光光譜等方法測(cè)定了含糖聚合物膠束的表面形貌、粒徑大小及分布、臨界膠束濃度等；通過(guò)激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)分別考察了肝癌細(xì)胞對(duì)含糖膠束的特異性吞噬作用；通過(guò)尾靜脈注射的方式將膠束溶液分布到小鼠體內(nèi)給藥不同時(shí)間后將小鼠處死利用CRI活體成像系統(tǒng)和激光共聚焦顯微鏡等手段考察了含糖膠束在體內(nèi)的分布情況包括小鼠的離體器官、冰凍組織切片、組織勻漿液結(jié)果表明該多功能混合膠束體系具有顯著的肝靶向效應(yīng)。4應(yīng)用上述2、3中含糖材料與鍵合藥物高分子PEGPLADHP／DOX制備了混合膠束考察了載藥膠束小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性包括給藥后瘤徑瘤體積的變化、體重的變化等。

簡(jiǎn)介：天津大學(xué)碩士學(xué)位論文納米水分子簇的特性與生物學(xué)效應(yīng)姓名楊海艷申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)制藥工程指導(dǎo)教師那平20090501ABSTRACTTHEBIOLOGICALEFFECTSANDSECURITYRESEARCHOFNANOMATERIALSHAVEENTEREDSYSTEMATICALANDLARGESCALERESEARCHSTAGERECENTLYTHEEXPLORATIONOFPHYSICALPROPERTYWHICHINCLUDESTHESTRUCTUREOFNANOSCALEWATERCLUSTERMOLECULARBEHAVIORHYDROGENBONDNETWORKANDSOON，ANDTHEBIOLOGICALPHYSIOLOGICALFUNCTIONOFNANOSCALEWATERCLUSTERHAVEBECOMETHENEWFOCUSINTHERESEARCHOFCLUSTERSTHESTRUCTURESANDPHYSICALCHARACTERISTICSOFWATERCLUSTERARESTUDIEDINTHISPAPERTHEBIOLOGICALEFFECTSOFWATERCLUSTERSONTHECHANGESOFPROTEINSTRUCTUREANDCELLGROWTHAREINVESTIGATEDBYCDANDUVANDTHENTHEEFFECTSOFNANOMETERCLUSTERWATERONPROTEINARESTUDIEDINADDITION，WEINVESTIGATETHEMENTALSTATE，F(xiàn)ASTINGBLOODGLUCOSE，GLUCOSETOLERANCEOFTHEMOUSEWHICHISCULTUREDBYNANOSCALEWATERCLUSTEROFDIFFERENTSIZES，ANDTHENTHEBIOLOGICALSAFETYOFNANOMETERCLUSTERSWATERISSTUDIEDTHESTRUCTURESANDPHYSICALCHARACTERISTICSEXPERIMENTRESULTSSHOWTHAT，COMPAREDTOORDINARYWATER，THECONDUCTIVITYOFNANOMETERWATERCLUSTERINCREASEDNEARLY30TIMES，THEDENSITYINCREASEDBY043MG／ML，ANDTHEOSMOTICPRESSUREOFNANOMETERCLUSTERWATERINCREASEDSIGNIFICANTLYTHESTRUCTUREOFORDINARYWATERANDNANOMETERCLUSTERWATERISANALYSEDBYDSC，UVANDXRDTHERESULTSSHOWTHATTHENANOMETERCLUSTERWATERISMOREORDERLYTHANTHEORDINARYWATER，THECLUSTERSOFNANOMETERCLUSTERWATERARESMALLERANDTHECAPACITYOFNANOMETERCLUSTERWATERCARRYINGIONSANDPROTONSISENHANCEDTHEBIOLOGICALEFFECTEXPERIMENTSSHOWTHAT，NANOMETERCLUSTERWATERCANWEAKENTHEDEGREEOFDENATURATIONINTHEPROCESSOFHEATDENATURATIONOFLYSOZYMENANOMETERCLUSTERWATERINHIBITESTHEGROWTHOFESCHERICHIACOLITHEPHARMACODYNAMICSFUNCTIONEXPERIMENTSHOWSTHATTHEBODYWEIGHTOFMICEWITHVIRUSISCONTINUEDTOINCREASE，WITHAPATHETICMENTALSTATE，UNRESPONSIVE，SLOWANDDARKGLOSSYFURANDATTHESAMETIME，THEFASTINGBLOODGLUCOSEOFMICEISDYNAMICALYOBSERVEDANDTHERESULTSSHOWTHATTHEFASTINGBLOODGLUCOSEOFTHEMICE，WHICHISCULTUREDWITHNANOMETERCLUSTERSWATERCONJUNCTEDWITHJIANGTANGLING，ISSTEADYDECLINEDTHEGLUCOSETOLERANCEOFMICEWHICHHASBEENCULTUREDFOR35DAYSISTESTED，ANDTHERESULTSHOWSTHATTHEGLUCOSETOLERANCEOFALLMICEISSTABLEINTWOHOURS，WHILETHEGLUCOSETOLERANCEOFTHEMICE，WHICHARECULTUREDBYNANOMETERCLUSTERSWATERCONJUNCTEDWITHJIANGTANGLING，ISDECREASEDSIGNIFICANTLY；THECONTENT

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簡(jiǎn)介：本文建立了五種常見肉類、四種犬科動(dòng)物和驢肉中摻雜牛肉的PCR方法牛、羊肉的真實(shí)性鑒定的PCRRFLP和TAQMAN實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。1、分別使用設(shè)計(jì)的牛、羊、豬、雞和鴨的特異性引物對(duì)，對(duì)牛、羊、豬、雞和鴨肉的總DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了大小為494、716、611、259和350BP的擴(kuò)增產(chǎn)物，又加以限制性酶切反應(yīng)，證實(shí)了PCR擴(kuò)增的特異性運(yùn)用這五對(duì)引物，檢測(cè)了摻雜牛、豬、雞和鴨肉的羊肉，結(jié)果顯示，該方法的檢出限可以達(dá)到1％以下進(jìn)而建立了運(yùn)用PCR技術(shù)準(zhǔn)確、有效地鑒別五種常見動(dòng)物肉類成分的方法。2、分別使用設(shè)計(jì)的狐貍、貉子、水貂和家犬的特異性引物對(duì)，對(duì)狐貍、貉子、水貂和家犬的總DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了大小為701、840、382和473BP的擴(kuò)增產(chǎn)物，又加以限制性酶切反應(yīng)，證實(shí)了PCR擴(kuò)增的特異性。進(jìn)而建立了運(yùn)用PCR技術(shù)準(zhǔn)確、有效地鑒別四種犬科動(dòng)物的方法。3、通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物將目的片段DNA進(jìn)行擴(kuò)增，建立鑒別驢肉中摻假牛肉PCR鑒別方法。分別用牛和驢的特異性引物對(duì)，對(duì)牛、驢的總DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了大小為494BP和261BP的擴(kuò)增產(chǎn)物，又加以限制性酶切反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了牛的PCR擴(kuò)增的特異性。結(jié)果表明，該方法可以準(zhǔn)確、有效地鑒別出驢肉和牛肉。4、通過(guò)一對(duì)通用引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增后，經(jīng)ALUI酶切，建立了牛羊肉的PCRRFLP快速鑒別方法。以五種純?nèi)鈽悠返目侱NA作為模板，均用通用引物對(duì)，進(jìn)行了PCR反應(yīng)，均能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為435445BP的片段各PCR產(chǎn)物經(jīng)ALUI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物都符合軟件設(shè)計(jì)。結(jié)果表明，該方法可以有效從五種常見肉種中鑒別出牛、羊肉。為了研究方法對(duì)摻假牛羊肉的適用性，制成了摻雜不同比例豬肉的牛、羊肉樣品，并提取了這些樣品的總DNA，然后均用通用引物對(duì)擴(kuò)增、ALUI酶切，結(jié)果對(duì)于摻雜牛、羊肉樣品，都只有當(dāng)豬肉摻雜比例≥30％時(shí)才有明顯的酶切條帶，僅能在一定范圍內(nèi)適用，對(duì)于市場(chǎng)上相當(dāng)一部分摻假牛羊肉不適用。本研究建立的PCRRFLP方法對(duì)于純?nèi)獾呐?、羊肉真?shí)性鑒定準(zhǔn)確、可靠對(duì)于摻假牛、羊肉僅能在一定范圍內(nèi)適用，具有一定的參考性。5、應(yīng)用五套TAQMAN實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系（引物和TAQMANMGB探針）對(duì)整塊肉和碎肉進(jìn)行牛羊肉真實(shí)性鑒定。檢測(cè)范圍包括牛肉中摻假豬肉，羊肉中摻假牛、豬或鴨肉。對(duì)于整塊肉，不存在以其他肉類摻假的可能，使用牛和羊的TAQMAN實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系建立了通過(guò)CT值直接鑒別牛羊肉真實(shí)性的方法。對(duì)于碎肉，使用四套TAQMAN實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系建立檢測(cè)方法，通過(guò)CT值判斷或排除常見牛肉中摻雜豬肉（羊肉中摻雜牛、豬或鴨肉）的可能。這種方法為檢測(cè)和執(zhí)法人員提供了進(jìn)行定性判斷牛羊肉中是否摻雜其它肉類一定量的依據(jù)。

簡(jiǎn)介：隨著人類基因組計(jì)劃HUMANGENOMEPROJECT以及分子生物學(xué)、信息科學(xué)的發(fā)展，不同學(xué)科的生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)“爆炸”式增長(zhǎng)。如何整合這些數(shù)據(jù)資源發(fā)現(xiàn)其中隱藏的知識(shí)一直是系統(tǒng)生物學(xué)研究的難點(diǎn)。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)是完全不同的學(xué)科，是一個(gè)互補(bǔ)性知識(shí)系統(tǒng)。本文結(jié)合中醫(yī)藥文獻(xiàn)庫(kù)和MEDLINE開展整合文本挖掘INTEGRATIVETEXTMINING，對(duì)中醫(yī)證和分子生物學(xué)進(jìn)行的關(guān)聯(lián)分析研究具有重要意義。信息抽取是文本挖掘中一項(xiàng)重要技術(shù)，是在非結(jié)構(gòu)化的自然語(yǔ)言文本中定位相應(yīng)的結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)單元，從而使自由文本數(shù)據(jù)成為相應(yīng)的結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)。信息抽取是文本挖掘的前期步驟和基礎(chǔ)，基于信息抽取的文本挖掘系統(tǒng)是研究趨勢(shì)所在。本文在系統(tǒng)分析和闡述信息抽取技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用開展了生物醫(yī)學(xué)文本挖掘研究。在利用BUBBLEBOOTSTRAPPING算法抽取中文實(shí)體名稱研究的基礎(chǔ)上，對(duì)該算法進(jìn)行了必要的改進(jìn)，將其應(yīng)用到基因名稱的抽取中。通過(guò)對(duì)2000篇英文摘要的抽取實(shí)驗(yàn)，表明BUBBLEBOOTSTRAPPING算法在英文實(shí)體名稱抽取領(lǐng)域同樣具有良好的應(yīng)用前景。其次，在信息整合的思路下，本文結(jié)合中醫(yī)藥文獻(xiàn)和生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)進(jìn)行了中醫(yī)證候基因相關(guān)關(guān)系知識(shí)發(fā)現(xiàn)研究。設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了基于整合挖掘的中醫(yī)證和分子生物學(xué)知識(shí)的關(guān)聯(lián)分析系統(tǒng)MEDISCO3S。該系統(tǒng)具備MEDLINE數(shù)據(jù)自動(dòng)下載、術(shù)語(yǔ)實(shí)體識(shí)別、實(shí)體相互關(guān)系計(jì)算、可視化展現(xiàn)和網(wǎng)絡(luò)圖分析等功能。

簡(jiǎn)介：聚氨基酸具有水溶性、生物可降解性以及生物相容性等，在食品、醫(yī)藥和工業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究對(duì)Γ聚谷氨酸合成菌株BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENSLL3進(jìn)行全基因組測(cè)序，對(duì)基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。研究了BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENSLL3基因組的IS序列、噬菌體相關(guān)序列和跨膜蛋白等，對(duì)BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENSLL3細(xì)胞內(nèi)的LD谷氨酸代謝通路進(jìn)行分析，對(duì)Γ聚谷氨酸相關(guān)的生物合成和代謝調(diào)控基因進(jìn)行了研究。為深入開展Γ聚谷氨酸的分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。本研究分別從福建古田和遼寧沈陽(yáng)農(nóng)田土壤中，利用添加亞甲基藍(lán)的甘油合成平板初篩，以DRAGENDFF試劑復(fù)篩，分離得到兩株Ε聚賴氨酸合成菌株。根據(jù)16SRDNA序列特征，確定均為鏈霉菌屬根據(jù)伯杰氏手冊(cè)第八版中的鏈霉菌屬檢索表，進(jìn)行了培養(yǎng)特征和碳源利用試驗(yàn)。結(jié)果顯示出兩菌株均為小白色鏈霉菌（STREPTOMYCESALBULUS）。被分別命名為STREPTOMYCESALBULUSNK660和STREPTOMYCESALBULUSNK49。本研究利用正交設(shè)計(jì)方法，對(duì)STREPTOMYCESALBULUSNK660發(fā)酵生產(chǎn)Ε聚賴氨酸的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳碳源和氮源分別是甘油、蛋白胨和硫酸銨。正交試驗(yàn)極差分析顯示，甘油是影響最為顯著的因素，STREPTOMYCESALBULUSNK660合成Ε聚賴氨酸的培養(yǎng)基的最佳組合為甘油30GL，蛋白胨7GL，硫酸銨4GL。方差分析顯示，得到的結(jié)果在99％的置信區(qū)間內(nèi)影響顯著。30L規(guī)模的控制PH條件下補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)表明，STREPTOMYCESALBULUSNK660在培養(yǎng)210H后得到Ε聚賴氨酸產(chǎn)量為419GL。對(duì)發(fā)酵液中產(chǎn)物提取方法進(jìn)行了探索，研究弱酸型離子交換樹脂D152對(duì)Ε聚賴氨酸的吸附曲線，最大吸附量以及發(fā)酵液PH對(duì)吸附的影響。利用核磁共振，飛行時(shí)間質(zhì)譜，傅里葉紅外光譜分析，對(duì)兩株Ε聚賴氨酸合成菌株的產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定和分析。結(jié)果表明，產(chǎn)物的核磁共振圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品一致飛行時(shí)間質(zhì)譜的結(jié)果表明，STREPTOMYCESALBULUSNK660產(chǎn)物分子量為24534248，聚合度為1933STREPTOMYCESALBULUSNK49產(chǎn)物分子量為27104376，對(duì)應(yīng)聚合度為2234。由于Ε聚賴氨酸的抗菌機(jī)理與聚合度緊密相關(guān)，所以不同聚合度的Ε聚賴氨酸具有不同抗菌譜，在不同的領(lǐng)域具有應(yīng)用價(jià)值。另外，本研究利用分子生物學(xué)手段，對(duì)Ε聚賴氨酸合成菌株STREPTOMYCESALBULUSNK660的合成酶進(jìn)行了研究。采用染色體步移技術(shù)，在STREPTOMYCESALBULUSNK660中克隆到了Ε聚賴氨酸合成酶全基因。利用鏈霉菌中的高拷貝克隆載體PHZ1358，在Ε聚賴氨酸合成酶基因自身啟動(dòng)子的控制下，首次在STREPTOMYCESLIVIDANSZX7中實(shí)現(xiàn)了Ε聚賴氨酸合成酶基因的異源表達(dá)。異源表達(dá)對(duì)于研究Ε聚賴氨酸生物合成的分子機(jī)制和合成菌株培養(yǎng)條件的簡(jiǎn)化都具有重要意義。在發(fā)酵過(guò)程中溶氧是Ε聚賴氨酸合成的主要限制因素。本研究首次在Ε聚賴氨酸合成菌株中表達(dá)了透明顫菌血紅蛋白VHB，以解決在發(fā)酵過(guò)程中的溶氧限制問(wèn)題。利用位點(diǎn)特異性整合載體PSET152，將透明顫菌血紅蛋白基因VGB整合到STREPTOMYCESALBULUSNK660染色體的ATTB位點(diǎn)，構(gòu)建了穩(wěn)定的工程菌株STREPTOMYCESALBULUSNK660VHB。利用CO差光譜法，檢測(cè)到工程菌株中血紅蛋白的表達(dá)量明顯。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，由于STREPTOMYCESALBULUSNK660VHB溶氧利用率的提高，其生長(zhǎng)速度明顯加快、菌體量增多，Ε聚賴氨酸產(chǎn)量比野生菌株提高了27％。

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簡(jiǎn)介：生物可降解材料、藥物靶向和緩釋材料等可供選擇的種類，難以滿足日益發(fā)展的環(huán)境保護(hù)和藥物治療的需要。Γ聚谷氨酸ΓPGA因其良好的水溶性、生物降解性、生物相容性和安全無(wú)毒性，以及分子鏈上具有的高活性側(cè)鏈羧基，易于發(fā)生交聯(lián)、螯合和衍生化，在醫(yī)藥、食品、化妝品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景和巨大的開發(fā)潛力。目前，亟需解決的是如何提高單位產(chǎn)量以降低成本，并實(shí)現(xiàn)對(duì)單體組成和分子量的可控性，這就要求從ΓPGA的生物合成途徑進(jìn)行深入研究。本研究從發(fā)酵食品中分離到4株谷氨酸依賴型和1株非谷氨酸依賴型ΓPGA合成菌，通過(guò)16SRRNA和BIOLOG初步鑒定為BACILLUSLICHENIFMISCDL1，BSUBTILISCDL2，BSUBTILISCDL16，BSUBTILISCDL17和BSUBBTILISCDL19。利用紫外光譜掃描、TLC、1HNMR、RTHPLC和GPC等技術(shù)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和分析，結(jié)果表明5株菌合成的ΓPGA產(chǎn)物中D谷氨酸含量在580％～3395％之間，重均分子量MW為347KD～443KD，分散度為119～144。低D谷氨酸單體含量、低分子量和分子量分布小的ΓPGA在醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域具有很大應(yīng)用價(jià)值。本研究利用分子微生物學(xué)手段，對(duì)本室的谷氨酸依賴型BLICHENIFMISNK03和谷氨酸非依賴型ΓPGA合成菌BACILLUSSPLL3產(chǎn)ΓPGA進(jìn)行了深入研究。首先，采用特異性細(xì)菌促旋酶基因GYRA，將BACILLUSSPLL3進(jìn)一步鑒定為BAMYLOLIQUEFACIENSLL3，并首次克隆獲得其ΓPGA合成酶基因PGSBCA。通過(guò)與BAMYLOLIQUEFACIENSFZB42、BSUBTILIS168、BLICHENIFMISATCC14580、BPUMILUSSAFR032等標(biāo)準(zhǔn)菌株的PGSBCA氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PGSB和PGSC具有9435和9409高度同源性，而PGSA差異性較大，只有7985致性。設(shè)計(jì)含有PGSBCA基因的表達(dá)載體PTRCPGS，以及PGSBCA、谷氨酸消旋酶基因RACE的雙基因重組載體PTRCRP，分別在ECOLIJM109進(jìn)行表達(dá)。在以葡萄糖或L谷氨酸作為底物的LB含MG2和MN2培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果顯示L谷氨酸相對(duì)于葡萄糖為更好的底物，含LL3PGSBCA的重組菌其ΓPGA產(chǎn)量高于NK03，推測(cè)來(lái)源于LL3的PGSBCA比NK03催化能力要強(qiáng)，較強(qiáng)的催化能力要求更多的L谷氨酸底物供應(yīng)；當(dāng)培養(yǎng)基中提供足夠的L谷氨酸時(shí)，聚合酶催化合成的ΓPGA差距明顯縮小，這表明足量的底物供應(yīng)可能比合成酶催化能力對(duì)高產(chǎn)ΓPGA更為重要，PGSBCA可能不是ΓPGA合成菌分型的決定因素。另外，通過(guò)穿梭載體PXMJ19將NK03菌株的PGSBCA基因以原生質(zhì)體方法轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌CGLUTAMICUMATCC13032，在CGLUTAMICUM生產(chǎn)L谷氨酸的培養(yǎng)基中加入IPTG誘導(dǎo)后，可以合成產(chǎn)量為069GL、重均分子量（MW）為73071、D谷氨酸單體占3的ΓPGA，實(shí)現(xiàn)了ΓPGA以糖類為底物的“一步法”合成。以正交設(shè)計(jì)方法對(duì)BAMYLOLIQUEFACIENSLL3發(fā)酵生產(chǎn)ΓPGA的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。分析結(jié)果表明，蔗糖對(duì)試驗(yàn)組影響最大、為最顯著因子，最優(yōu)組合為蔗糖50GL、NH42S042GL和MGS0406GL，此時(shí)ΓPGA產(chǎn)量提高了32倍。在此配方基礎(chǔ)上進(jìn)行了30L和200L的體系放大，發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、相對(duì)粘度、ΓPGA產(chǎn)量和蔗糖利用等過(guò)程參數(shù)呈現(xiàn)穩(wěn)態(tài)變化，其中200L體系培養(yǎng)44H時(shí)ΓPGA最高產(chǎn)量為436GL，接近2GLNH42S04全氨基轉(zhuǎn)移作用可能生成的量446GL，而NH42S04可能成為限制放大發(fā)酵產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。另外，采用苯酚硫酸法測(cè)定了LL3發(fā)酵生產(chǎn)ΓPGA時(shí)含有的多糖副產(chǎn)物成分占到了36，于是嘗試構(gòu)建打靶載體，借助同源重組將多糖基因從LL3染色體中進(jìn)行敲除。本研究已經(jīng)擴(kuò)增到胞外多糖合成關(guān)聯(lián)基因EPSA上下游同源區(qū)片段，并以PET30AKANΤ作為篩選標(biāo)記，3個(gè)片段混合連接于PBLUESENPTSK質(zhì)粒上，構(gòu)建打靶載體PBSUKD。目前在探索野生菌LL3的轉(zhuǎn)化方法，期望借助EPSA基因敲除后可能引起的代謝流改變，提高LL3合成ΓPGA的能力。

簡(jiǎn)介：近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，大西洋鮭魚、鱈魚等高值水產(chǎn)品的消費(fèi)量逐年增大。隨著水產(chǎn)品貿(mào)易量增加，加工方式多樣化，水產(chǎn)品及其加工品相關(guān)的商業(yè)欺詐現(xiàn)象也在增加，采用低值水產(chǎn)品冒充高值水產(chǎn)品的行為時(shí)有發(fā)生，不僅破壞了水產(chǎn)品貿(mào)易的公平性，也損害了消費(fèi)者的合法權(quán)益，甚至帶來(lái)食品安全問(wèn)題。因此建立快速、簡(jiǎn)便的水產(chǎn)品種類鑒定方法，對(duì)于規(guī)范水產(chǎn)品市場(chǎng)、保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益至關(guān)重要，對(duì)于維護(hù)水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要的意義。傳統(tǒng)的水產(chǎn)品鑒定方法主要依據(jù)水產(chǎn)品的外部形態(tài)和解剖特征，但這種方法不適用于加工后的水產(chǎn)品種類鑒定。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA已經(jīng)被證明幾乎是所有生物最主要的遺傳物質(zhì)，基于DNA技術(shù)的分子生物學(xué)方法在鑒定食品真?zhèn)畏矫姘l(fā)揮越來(lái)越重要的作用。本論文研究了基于PCR技術(shù)的水產(chǎn)加工品種類鑒定方法。針對(duì)不同水產(chǎn)加工品進(jìn)行DNA提取方法的比較。以凍魚塊、烤魚片、魚罐頭共3種主要水產(chǎn)加工品為研究對(duì)象，比較CTAB法、改良CTAB法、酚氯仿法、SDS法以及5種試劑盒法共9種方法對(duì)3種主要水產(chǎn)加工品DNA提取效果。通過(guò)比較DNA得率以及純度對(duì)各提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，并采用PCR方法對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品的真?zhèn)芜M(jìn)行了初步鑒別。結(jié)果表明9種提取方法對(duì)于3種水產(chǎn)加工品所提取DNA得率相差較大，對(duì)于凍魚塊采用TIANGEN深加工食品DNA提取試劑盒提取DNA得率最高1223ΜGMG，純度A260A280為20對(duì)于烤魚片采用SDS法提取得率最高0505ΜGMG，純度A260280為203對(duì)于魚罐頭采用SDS法提取DNA得率最高為0594ΜGMG，純度A260A280為193。所提取DNA可滿足后續(xù)PCR鑒定實(shí)驗(yàn)的要求。本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)并篩選出水產(chǎn)加工品DNA提取的最佳方法，為后續(xù)水產(chǎn)加工品的原料真?zhèn)畏肿由飳W(xué)鑒別奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。利用PCRFINS方法對(duì)大西洋鮭SALMOSALAR以及市場(chǎng)上常被用來(lái)冒充大西洋鮭的虹鱒ONCHYNCHUSMYKISS和白斑紅點(diǎn)鮭（SALVELINUSLEUCOMAENIS）進(jìn)行鑒別，對(duì)三種魚類COI和16SRRNA部分序列測(cè)序，利用DNAMAN60和MEGA41軟件對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行分析，計(jì)算三種魚類堿基組成，種問(wèn)遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離，利用鄰接法構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹。結(jié)果表明三種魚類種問(wèn)遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離，三種魚類16SRRNA基因較COI基因相對(duì)保守，三種魚類在系統(tǒng)樹分類中分別形成各自獨(dú)立的分支，表明以COI和16SRRNA基因作為標(biāo)記基因可以對(duì)大西洋鮭及常被用來(lái)冒充大西洋鮭的虹鱒和白斑紅點(diǎn)鮭進(jìn)行鑒別。采用DNAMAN60對(duì)大西洋鮭SALMOSALAR及常被用來(lái)冒充大西洋鮭的虹鱒ONCHYNCHUSMYKISS和白斑紅點(diǎn)鮭SALVELINUSLEUCOMAENIS的線粒體COI基因部分序列進(jìn)行分析，建立限制性內(nèi)切酶圖譜，選擇APAⅠ，BSTⅪ，HINDⅢ，SACⅠ，VSPⅠ共五種限制性內(nèi)切酶用于三種魚類PCRRFLP的分析。采用限制性內(nèi)切酶對(duì)三種魚類線粒體COI基因進(jìn)行酶切，酶切結(jié)果與分析結(jié)果吻合，沒有非特異性酶切條帶的出現(xiàn)，酶切片段均能通過(guò)電泳進(jìn)行明顯的區(qū)分。結(jié)果表明，本研究選取五種限制性內(nèi)切酶，共六種組合方式對(duì)三種魚類進(jìn)行鑒別，建立的PCRRFLP方法能快速鑒別大西洋鮭、虹鱒和白斑紅點(diǎn)鮭。采用FINS方法對(duì)市售鱈魚樣品進(jìn)行鑒別研究，通過(guò)對(duì)鱈魚樣品線粒體COI和16SRRNA部序列進(jìn)行測(cè)序，鑒別各商品化鱈魚樣品中魚源性成分，以判定其與標(biāo)簽中注明是否相符。結(jié)果顯示，17種凍鱈魚塊樣品中，有7種存在貼標(biāo)不明確的現(xiàn)象，未標(biāo)明物種的凍鱈魚塊主要為價(jià)格較便宜的狹鱈采用油炸、水煮、烘干后的鱈魚樣品依然可以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別采集的4種烤鱈魚片樣品測(cè)序結(jié)果均與商品名稱不符，四種烤鱈魚片樣品分析結(jié)果分別為網(wǎng)紋獅子魚（LIPARISCHEFUENSIS）、月尾兔頭鲀（LAGOCEPHALUSLUNARIS）、暗紋東方鲀（TAKIFUGUFIATUS）、黑尾吻鰻（RHYNCHOCONGERECTENURUS）。結(jié)果表明利用線粒體COI基因和16SRRNA基因通過(guò)FINS方法可以對(duì)市場(chǎng)上常見鱈魚加工品原料真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別。