簡(jiǎn)介：分類號(hào)墨壘墨至密級(jí)五洳≯J～瑩。單位代碼學(xué)號(hào)博士學(xué)位論文⑧指導(dǎo)教師10335AUTHOR’SSIGNATURELINGZHEHUANG一__‘O一T__UL1______一一●■●1’’一一一‘，‘SUPERVISOR7SSIGNATUREKONGXLANGFANG乙一一OOOO‘?！疧’’’‘。OOOOOO■■__一，一XUELP‘INK1__OHO‘OO_OUO__一THESISREVIEWER1THESISREVIEWER2』迪QNY班Q叢墨YTHESISREVIEWER3THESISREVIEWER4●THESISREVIEWER5COMMITTEEMAN1PROFJIANHONKZJU●_。_‘。。。。。_‘‘。。。。‘‘。?！?。。。’一L。。。‘’。。。●●_L_L_●_________●____●__●_。●。___●_一COMMITTEEMAN2COMMITTEEMAN3PROFZHONGHUAMAZJU。。?！馹_。。I‘。。。。。。‘一I_1I|__________●_____●_●___●____●_●_L●一COMMITTEEMAN4COMMITTEEMAN5COMMITTEEMAN6DATEOFORALDEFENCEDECEMBER16TH201L

簡(jiǎn)介：華中師范大學(xué)碩士學(xué)位論文我國(guó)首株藍(lán)藻病毒（噬藻體）的分子生物學(xué)特征姓名祝海燕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)微生物指導(dǎo)教師趙以軍石正麗200251ABSTRACTINTHISTHESIS．THEFISTCYANOPHAGEISOLATEDINCHINAWASINVESTIGATEDWITHREGARDTOTHEMOLECULARBIOLOGICALCHARACTERS．TECHNIQUESFORTHELARGEHARVESTANDTHEELECTRONICMICROSCOPYNEGATIVESTAININGOFTHECYANOPHAGEWEREESTABLISHED．THEGENOMELIBRARYWASCONSTRUCTED．SEQUENCINGFORSOMEGENOMEFRAGMENTSWASCONDUCTED．FURTHERMORE．THESEQUENCESWERCANALYZEDANDCOMPARED、撕TLLTHESEQUENCEDATAINGENBANK．THERESULTSINDICATEDTHATTHECYANOPHAGEREPRESENTEDAPHAGELIKESHAPEWITLLHEADDIAMETERCA．4752NMANDASHORTTAILALMOSTINVISIBLETHECYANOPHAGECONTAINEDADOUBLESTRANDEDDNAGENOMEATCA．36．6KB．THEGENOMECOULDBEDIGESTEDONLYBYRESTRICTIONENDONUCLEASESHINDLII，ACCIANDXBAI，ANDWASRESISTANTTOCLEAVAGEBYAWIDERANGEOFOTHERRESTRICTIONENDONUCLEASES．PLASMIDPUCL8WASUSEDTOCONSTRUCTVIRALGENOMELIBRARY．TENFRAGMENTSWEREOBTAINEDANDSOMEOFTHEMWEREPARTIALLYSEQUENCEDANDANALYSEDUSINGGENBANKDATA．SEQUENCEANALYSISREVEALEDTHATMOSTOFTHESEQUENCESSHOWED110SIMILARITIESTOTHEKNOWNGENESEXCEPTTHATONLYTWOSEQUENCESGAVERISETOSOMESIMILARITIES．INTHEM，ONEOWNEDACONSEVEDDOMAINOF、JASE__SUBA，ANOTHERCODEDAPROLINERICHPROTEIN．WHICHHASMULTIPLEPHOSPHATESITES．KEYWORDSCYANOPHAGEPLECTONEMANUCLEICACIDCH眥CTCRSDNALIBRARYHOMOLOGYCOMPARISONII

簡(jiǎn)介：目的通過(guò)比較皮肌炎DERMATOMYOSITIS，DM患者與正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BONEMARROWDERIVEDMESENCHYMALSTEMCELLS，BMSCS的生物學(xué)性狀，探討DM患者BMSCS是否存在缺陷或變異，能否應(yīng)用于自體移植，抑或DM本身就是一種干細(xì)胞疾病，與DM的發(fā)病相關(guān)，從而為DM患者BMSCS自體移植的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法1分別采集5例DM患者與正常入骨髓各5ML8ML，用密度梯度離心及貼壁法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)、傳代，流式細(xì)胞儀鑒定P3代BMSCS的表面標(biāo)志。2兩組人群BMSCS增殖能力的比較MTT法測(cè)定P3、P6代BMSCS生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期，計(jì)算增殖指數(shù)；實(shí)時(shí)熒光定量PCRREALTIMEPOLYMERASECHAINREACTION，RTPCR測(cè)定端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶HUMANTELOMERASEREVERSETRANASE，HTERT的表達(dá)。3兩組人群BMSCS向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化能力的比較將P3代細(xì)胞分別在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液HDMEM培養(yǎng)液10％胎牛血清100UML青霉素100PGML鏈霉素10NGMLVEGF5NGMLBFGF中培養(yǎng)，并將LDMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)的正常人BMSCS做為陰性對(duì)照，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)，14D時(shí)免疫組織化學(xué)檢測(cè)Ⅷ因子的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體KINASEDOMAINCONTEININGRECEPT，KDR表達(dá)的情況，從而鑒定BMSCS原性內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果1兩組人群均可成功分離、培養(yǎng)得到BMSCS，在P3代時(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)上未見(jiàn)明顯差異，細(xì)胞貼壁后形態(tài)均一，長(zhǎng)梭形或多角形，呈平行、旋渦狀、輻射狀排列。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD34、CD45陰性，CD44陽(yáng)性，CD71弱陽(yáng)性，鑒定為間充質(zhì)干細(xì)胞。2兩組人群BMSCS增殖能力的比較正常對(duì)照組P3代時(shí)細(xì)胞群體倍增時(shí)間為473±031D，DM組為476±032D，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞005P6代時(shí)正常對(duì)照組細(xì)胞群體倍增時(shí)間為574±035D，DM組為614±034D，DM組BMSCS群體倍增時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0001。正常對(duì)照組P3代BMSCS增殖指數(shù)為1787±205％，DM組為1712±200％，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005；P6代正常對(duì)照組BMSCS增殖指數(shù)為1073±178％，DM組為596±216％，DM組增殖指數(shù)小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜001。正常對(duì)照組P6代BMSCSHTERT表達(dá)量為1063±149，DM組為645±204，DM患者HTERT表達(dá)水平較正常對(duì)照組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜001。3兩組細(xì)胞均在誘導(dǎo)培養(yǎng)14D后免疫組化檢測(cè)Ⅷ因子的表達(dá)為陽(yáng)性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)KDR、CD34表達(dá)為陽(yáng)性，DM組與對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)CD34相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005。DM組與對(duì)照組細(xì)胞相比表達(dá)KDR較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005。這可能與樣本量較少有關(guān)，也可能是由于DM本身BMSCS異常所致。結(jié)論1兩組人群均可成功分離、培養(yǎng)得到BMSCS，且DM患者與正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異；2DM患者BMSCS在不同程度上存在缺陷；3兩組BMSCS體外均可誘導(dǎo)成類血管內(nèi)皮細(xì)胞，但誘導(dǎo)成的類血管內(nèi)皮細(xì)胞間存在一定差異；4DM患者BMSCS不適合自體移植，解決途徑可以考慮異體BMSCS移植。

簡(jiǎn)介：H背景和目的丙型肝炎病毒HEPATITISCVIRUS，HCV非結(jié)構(gòu)蛋5ANONSTRUCTURAL5A，NS5A作為HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有重要的生物學(xué)功能。NS5A蛋白參與HCV病毒復(fù)制、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抵抗細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生命活動(dòng)，與原發(fā)性肝癌HEPATOCELLULARCARCINOMA，HCC的發(fā)生關(guān)系密切。HCVNS5A可能通過(guò)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)而致病。生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷45Α基因GROWTHARRESTDNADAMAGE45ALPHAGADD45Α作為一個(gè)腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控阻滯和生長(zhǎng)抑制，維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定，在維持正常的細(xì)胞周期中發(fā)揮重要功能。第十號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因PHOSPHATASETENSINHOMOLOGDINCHROMOSOME10，PTEN作為另一種重要的腫瘤抑制基因，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)控，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)平衡。既往臨床研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者肝癌細(xì)胞GADD45Α和PTEN表達(dá)較正常肝細(xì)胞均明顯降低，提示GADD45Α和PTEN與原發(fā)性肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HCV作為原發(fā)性肝癌的主要致病因素之一，其誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的機(jī)制仍不十分清楚。在本課題中，我們研究HCVNS5A對(duì)GADD45Α和PTEN表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而探討GADD45Α和PTEN表達(dá)異常對(duì)HCV感染的肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在為HCV感染誘發(fā)肝癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法分別使用熒光素酶試驗(yàn)，相對(duì)定量RTPCR和免疫蛋白印跡檢測(cè)HCVNS5A對(duì)GADD45Α和PTEN啟動(dòng)子活性、MRNA轉(zhuǎn)錄、和蛋白表達(dá)影響。通過(guò)P53過(guò)表達(dá)或針對(duì)P53、NFΚB、和PI3K的小分子RNA干擾技術(shù)SMALLINTERFERINGRNAS，SIRNAS，研究HCVNS5A對(duì)GADD45Α表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。此外，通過(guò)細(xì)胞活性試驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估GADD45Α沉默或GADD45Α過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖活性的影響。同樣，使用小分子化學(xué)抑制劑和小分子RNA干擾技術(shù)探索HCVNS5A對(duì)PTEN表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。最后，通過(guò)CASPASE37活性試驗(yàn)和凋亡蛋白評(píng)估肝癌細(xì)胞在PTEN過(guò)表達(dá)和AKT活化抑制下的細(xì)胞凋亡。結(jié)果HCVNS5A在轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)下調(diào)GADD45Α啟動(dòng)子活性，MRNA轉(zhuǎn)錄，繼而下調(diào)GADD45Α蛋白表達(dá)。P53沉默能使GADD45Α表達(dá)下調(diào)，而P53過(guò)表達(dá)能廢除HCVNS5A對(duì)GADD45Α的下調(diào)作用。HCVNS5A下調(diào)P53表達(dá)，繼而導(dǎo)致下游GADD45Α表達(dá)降低。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明HCVNS5A促進(jìn)NFΚB和AKT磷酸化。使用針對(duì)NFΚB和PI3KAKT的小分子抑制劑或特異性SIRNAS，能抵消HCVNS5A對(duì)P53和GADD45Α的下調(diào)作用。另外，HCVNS5A蛋白通過(guò)抑制P53進(jìn)而下調(diào)GADD45Α蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)。而GADD45Α過(guò)表達(dá)抑制HCVNS5A誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。同樣發(fā)現(xiàn)，HCV在轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)PTEN啟動(dòng)子活性，MRNA轉(zhuǎn)錄，和PTEN蛋白表達(dá)。NS5A蛋白在HCV成熟蛋白中對(duì)PTEN下調(diào)作用最顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HCVNS5A通過(guò)ROS途徑促進(jìn)NFΚB磷酸化及非ROS途徑激活PI3KAKT磷酸化抑制PTEN蛋白表達(dá)。使用小分子抑制劑和SIRNAS抑制NFΚB和PI3KAKT通路，能廢除HCVNS5A對(duì)PTEN的下調(diào)。此外，PTEN過(guò)表達(dá)能拮抗PI3K對(duì)AKT的活化。而NS5A所致的PTEN表達(dá)缺失加強(qiáng)PI3K對(duì)AKT活化。缺失的PTEN和活化的AKT共同介導(dǎo)NS5A抑肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程。結(jié)論HCVNS5A通過(guò)下調(diào)GADD45Α表達(dá)繼而促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時(shí)HCVNS5A通過(guò)ROS依賴和非ROS依賴途徑激活NFΚB和PI3KAKT磷酸化抑制PTEN蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。這些研究表明HCVNS5A在HCV致肝癌產(chǎn)生中扮演重要角色。

簡(jiǎn)介：畜禽遺傳資源一直以來(lái)就是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基石，是人們生活的保障，它影響著社會(huì)與經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，家養(yǎng)動(dòng)物遺傳資源理應(yīng)受到重大的保護(hù)。干細(xì)胞所具有的自我更新和多向分化能力，為畜禽遺傳資源的保護(hù)開(kāi)辟了新思路。由于間充質(zhì)干細(xì)胞所具有的優(yōu)點(diǎn)，在遺傳資源保護(hù)與利用、組織工程學(xué)等方面得到廣泛認(rèn)可。本實(shí)驗(yàn)以肉雞脂肪和綿羊羊膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行了細(xì)胞分離培養(yǎng)、生物學(xué)特性、誘導(dǎo)分化及移植治療小鼠肝損傷的研究，得到以下結(jié)果1利用膠原酶Ⅰ分離得到肉雞ADSCS，并在體外培養(yǎng)37代，主要呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形經(jīng)RTPCR和免疫組化檢測(cè)，細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD71和CD73，而不表達(dá)CD31，分離培養(yǎng)的確實(shí)是脂肪來(lái)源的MSCS。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，CD29、CD44、CD71和CD73在肉雞ADSCS中高表達(dá)。ADSCS經(jīng)歷潛伏期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”形，符合細(xì)胞在體外增殖的一般規(guī)律。群體倍增時(shí)間和克隆形成能力表明隨著代次提高，細(xì)胞增殖能力減弱。通過(guò)細(xì)胞周期分析，發(fā)現(xiàn)G0G1期的ADSCS所占的比率，隨著傳代次數(shù)的提升而提升，而S期的細(xì)胞比率逐漸減小。通過(guò)對(duì)ADSCS進(jìn)行了誘導(dǎo)分化，分別在不同誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肝樣細(xì)胞，經(jīng)過(guò)特異性染色、RTPCR和免疫組織化學(xué)的證明，誘導(dǎo)形成的確實(shí)是目的細(xì)胞。驗(yàn)證了ADSCS的多向分化能力。2利用膠原酶Ⅱ和胰蛋白酶分離得到綿羊AMSCS，并在體外培養(yǎng)25代，主要呈現(xiàn)梭狀經(jīng)RTPCR和免疫組化檢測(cè)，細(xì)胞表達(dá)CD29、OCT4、CD71、CD44、REX1、CD90和CD73，分離培養(yǎng)的確實(shí)是羊膜來(lái)源的MSCS。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，OCT4、CD44、CD73和CD90在綿羊AMSCS中高表達(dá)。AMSCS經(jīng)歷潛伏期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”形，符合細(xì)胞在體外增殖的一般規(guī)律。群體倍增時(shí)間和克隆形成能力表明隨著代次提高，細(xì)胞增殖能力減弱。在體外對(duì)綿羊AMSCS進(jìn)行誘導(dǎo)分化研究，在適宜的體外條件下，通過(guò)特異性染色、RTPCR和免疫組織化學(xué)證明，綿羊AMSCS能分化成為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肝樣細(xì)胞，驗(yàn)證了AMSCS的多向分化潛能。3利用順鉑損傷小鼠肝臟，發(fā)現(xiàn)肝質(zhì)地變硬，形態(tài)改變，有散在出血點(diǎn)產(chǎn)生查看切片發(fā)現(xiàn)其正常構(gòu)造被損害，纖維組織出現(xiàn)增生血清學(xué)發(fā)現(xiàn)肝指標(biāo)均表現(xiàn)明顯的升高。將培養(yǎng)的ADSCS用熒光標(biāo)記，經(jīng)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)ADSCS能定植到肝小葉中央靜脈周?chē)透涡∪~的結(jié)締組織中，組織切片觀察和血清學(xué)分析表明，ADSCS對(duì)肝損傷有一定的治療效果。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)了肉雞ADSCS和綿羊AMSCS，進(jìn)行了生物學(xué)特性和誘導(dǎo)分化研究細(xì)胞移植治療肝損傷研究表明ADSCS能一定程度修復(fù)受損的肝。所示數(shù)據(jù)可得干細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)，對(duì)畜禽種質(zhì)資源的保護(hù)和利用具有重要意義，并為MSCS在組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

簡(jiǎn)介：本課題探討臍帶血中多潛能成體祖細(xì)胞MAPCS的分離方法，優(yōu)化MAPCS的培養(yǎng)條件。在此基礎(chǔ)上研究MAPCS的生物學(xué)特性以及臍帶血MAPCS的神經(jīng)分化潛能，為今后將其應(yīng)用于臨床提供相關(guān)的基礎(chǔ)理論和方法。一、低血清條件下影響臍帶血MAPCS分離的相關(guān)因素利用足月妊娠健康產(chǎn)婦胎兒新鮮臍帶血，分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞MNC，在低血清條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過(guò)比較不同培養(yǎng)基、不同接種密度以及不同的首次換液時(shí)間對(duì)臍帶血MAPCS生長(zhǎng)的影響，研究低血清條件下從臍帶血中分離MAPC的相關(guān)影響因素，探索優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立臍帶血MAPCS的分離培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，在低血清條件下，DMEMF12培養(yǎng)基更適合于臍帶血MAPC生長(zhǎng)；1106CM2是原代培養(yǎng)的適宜接種密度，原代第72小時(shí)首次換液為最佳換液時(shí)問(wèn)。臍帶血的質(zhì)量可能是影響分離效果的因素之一。利用所建立的人臍帶血MAPCS的體外優(yōu)化培養(yǎng)條件培養(yǎng)的細(xì)胞可于超過(guò)70％的臍帶血中分離出MAPCS并在體外持續(xù)擴(kuò)增，并具有良好的分化潛能。二、MAPCS的生物學(xué)特性以及臍帶血MAPCS的神經(jīng)分化潛能利用第一部分所建立的分離和培養(yǎng)體系，從新鮮臍帶血中分離臍帶血MAPCS，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期、細(xì)胞表型分析、體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)以及檢測(cè)其細(xì)胞因子的表達(dá)等。結(jié)果表明，73％的臍帶血標(biāo)本可以分離出MAPCS，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭狀，類似于成纖維細(xì)胞，90％以上細(xì)胞處于G0G1期，可以傳至810代以上而無(wú)形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MAPCS高表達(dá)常用于識(shí)別人間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記CD29、CD44、CD90以及CD73、CD105等，低表達(dá)CD144、VWF和CD49D，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34，CD45，CD14，CD3、HLADR、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31和整合素CD11A，具有與臍帶血來(lái)源MSC和USSCS類似的細(xì)胞免疫表型特征，而與PSC3445細(xì)胞存在明顯差別。MAPCS在一定的誘導(dǎo)分化劑的作用下可向神經(jīng)細(xì)胞、成骨和脂肪細(xì)胞分化，并能表達(dá)IL6、SCF、FL和GCSF等細(xì)胞因子。結(jié)論本研究探討了低血清條件下從臍帶血中分離MAPC的相關(guān)影響因素，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立了臍帶血MAPCS的分離培養(yǎng)體系。并利用這一體系從臍血中分離培養(yǎng)出MAPCS，研究了其生物學(xué)特性與多向分化潛能特別是神經(jīng)分化潛能，為臍帶血MAPCS在組織工程方面的應(yīng)用作出了新的探索。

簡(jiǎn)介：綴鰻次學(xué)學(xué)校代碼10246學(xué)蟹062023049專業(yè)姓名指導(dǎo)教師完成日期醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)周同余龍教授2009年05月20日復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文目錄目錄縮寫(xiě)詞1中文摘要2英文摘要3、‘J一日Ⅱ吾5材料和方法11一材料11二主要的儀器設(shè)備16三計(jì)算機(jī)分析軟件17四實(shí)驗(yàn)方法17結(jié)果32一KLK和FC基因的序列分析和克隆32二真核表達(dá)載體的構(gòu)建35三細(xì)胞實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)37四穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞株的篩選39五信號(hào)肽改造效果的檢測(cè)41六融合蛋白的純化43七融合蛋白的酶活性檢測(cè)44八生物信息學(xué)分析融合蛋白45討論46小結(jié)49參考文獻(xiàn)50文獻(xiàn)綜述54參考文獻(xiàn)60

簡(jiǎn)介：中國(guó)肄鴛斜學(xué)坼憲院學(xué)位論文學(xué)位論文作者指導(dǎo)老師姓名申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別專業(yè)名稱研究方向論文答辯日期李奎王雁研究員博士園林植物與觀賞園藝花卉遺傳改良2013年6月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得本研究生培養(yǎng)單位或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名日期少哆，R、6月砂戶|學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū)學(xué)位論文作者簽名山T≥年占具巧日彳名6。屯學(xué)位論文作者畢業(yè)聯(lián)系方式工作單位聯(lián)系電話電子郵件通訊地址、郵編導(dǎo)師簽名013年占月，汗坩一H‘

簡(jiǎn)介：隨著納米材料適用范圍的擴(kuò)大，納米材料引發(fā)了眾多的環(huán)境問(wèn)題，可能危及人類健康，因而有必要對(duì)其體外生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行研究。本論文對(duì)采用溶膠凝膠法制備的TIO2納米粒子，水熱合成法制備的TIO2納米棒和納米管用XRD和TEM進(jìn)行了表征。體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，MTT比色法評(píng)價(jià)不同形態(tài)、不同粒徑的納米TIO2TIO2納米顆粒、納米棒和納米管的細(xì)胞毒性等級(jí)，考察不同的染毒時(shí)間24H，48H及納米TIO2染毒濃度0，2，20，60，100ΜGML對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)、毒性等級(jí)、生化指標(biāo)的影響。測(cè)定細(xì)胞上清液中丙二醛MDA含量，乳酸脫氫酶LDH的活力，還原型谷胱甘肽GSH的含量。探討了不同的納米TIO2對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，細(xì)胞膜的損傷程度及氧化應(yīng)激水平。研究表明形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，TIO2納米粒子和TIO2納米棒對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)有一定的影響，且均能被巨噬細(xì)胞吞噬。而TIO2納米管對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)影響不如前二者明顯，且不能被巨噬細(xì)胞吞噬。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染毒24H后，相對(duì)于對(duì)照組，TIO2納米粒子1和TIO2納米棒2對(duì)巨噬細(xì)胞表現(xiàn)有明顯的毒性，TIO2納米顆粒2表現(xiàn)無(wú)毒性，其他均表現(xiàn)低毒，染毒48H后，兩種TIO2納米粒子和TIO2納米棒均有明顯的毒性，兩種TIO2納米管均表現(xiàn)低毒性。細(xì)胞上清液的MDA、LDH、GSH含量檢測(cè)結(jié)果表明，不同的納米TIO2對(duì)細(xì)胞上清液指標(biāo)影響均表現(xiàn)各異，有一定的濃度依賴性。表明細(xì)胞炎癥反應(yīng)、膜損傷程度及氧化應(yīng)激水平的高低是決定納米TIO2對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生毒性的主要影響因素。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多不同加工工藝對(duì)鈷鉻合金的理化性能及生物學(xué)影響的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：上海海洋大學(xué)上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文二O一六年五月日學(xué)校代碼10264研究生學(xué)號(hào)M130305667題目太平洋黃鰭金槍魚(yú)繁殖生物學(xué)研究太平洋黃鰭金槍魚(yú)繁殖生物學(xué)研究英文題目英文題目REPRODUCTIVEBIOLOGYOFYELLOWFINTUNATHUNNUSALBACESINTHEPACIFICOCEAN專業(yè)業(yè)海洋科學(xué)研究方向研究方向海洋生物學(xué)姓名陳麗雯指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師戴小杰教授上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫(xiě)，我對(duì)所寫(xiě)的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名日期年月日上海海洋大學(xué)學(xué)位論文上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)版權(quán)使用授權(quán)書(shū)學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密□，在年解密后適用本版權(quán)書(shū)。本學(xué)位論文屬于不保密□學(xué)位論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名日期年月日日期年月日

簡(jiǎn)介：腦利鈉肽（BRAINNATRIURETICPEPTIDE，BNP，又稱B型鈉尿肽）是于1988年由日本學(xué)者SUDOH等首次從豬腦中分離而得來(lái)的，但實(shí)際上腦利鈉肽的主要來(lái)源是心室、尤其是左心室為主。腦利鈉肽與A型利鈉肽ATRIALNATRIURETICPEPTIDE，ANP、C型利鈉肽CTYPENATRIURETICPEPTIDE，CNP同屬于利鈉肽（NATRIURETICPEPTIDE，NP）家族。利鈉肽家族是維持血壓穩(wěn)定及水、鹽代謝平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，心力衰竭HEARTFAILURE，HF時(shí)由于容量超載和心室壁張力增加，利鈉肽家族就被高度激活。利鈉肽家族具有調(diào)節(jié)血壓，利尿，擴(kuò)張心外膜以及冠狀動(dòng)脈，抑制血管平滑肌增殖，抑制血管組織增生等作用。所以利鈉肽家族在檢測(cè)和治療心血管系統(tǒng)疾病方面有著巨大的前景。腦利鈉肽是一種多肽類神經(jīng)激素，由32個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其中氨基端第7個(gè)和第23個(gè)殘基由二硫鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，形成腦利鈉肽的功能域。與其天然受體結(jié)合后，可激活其胞內(nèi)區(qū)的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶活性，催化三磷酸鳥(niǎo)苷GUANOSMETRIPHOSPHATE，GTP轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷CYCLICGUANOSINEMONOPHOSPHATE，CGMP。所以通過(guò)檢測(cè)CGMP含量可以測(cè)定重組人腦利鈉肽的生物學(xué)活性。通過(guò)分子克隆的方法，對(duì)人腦利鈉肽的基因序列進(jìn)行優(yōu)化合成，構(gòu)建表達(dá)載體，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序鑒定，并轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21原核表達(dá)系統(tǒng)中，篩選陽(yáng)性單克隆菌落，得到重組人腦利鈉肽的工程菌，并進(jìn)行腦利鈉肽大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，然后純化出重組人腦利鈉肽蛋白，最后建立酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定ENZYMELINKEDIMMUNOSBENTASSAY，ELISA活性的方法，用于腦利鈉肽的生物學(xué)活性測(cè)定。

簡(jiǎn)介：湖南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文從生物學(xué)走向哲學(xué)斯坦特的科學(xué)思想述評(píng)姓名殷雨萍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)科學(xué)技術(shù)哲學(xué)指導(dǎo)教師顏青山20090601終結(jié)。斯坦特從進(jìn)步達(dá)到自我限制的三個(gè)內(nèi)在矛盾心理的、物質(zhì)的和認(rèn)知的來(lái)對(duì)進(jìn)步終結(jié)的原因進(jìn)行了解釋。關(guān)鍵詞斯坦特，生物學(xué)哲學(xué)思想，科學(xué)終結(jié)論思想，科學(xué)極限

簡(jiǎn)介：研究背景冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病CONARYATHEROSCLEROTICHEARTDISEASE，CHD作為心血管病中發(fā)病率與死亡率均較高的心血管病之一，嚴(yán)重危害人們身體健康，而且這些年來(lái)其發(fā)病率在我國(guó)有顯著增加的趨勢(shì)，成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程受諸多因素影響，其中由于動(dòng)脈粥樣硬化ATHEROSCLEROSISAS斑塊形成造成的動(dòng)脈血管壁增厚、硬化、鈣化、斑塊破裂、血栓形成，最終導(dǎo)致管腔狹窄甚至閉塞，是以冠心病為代表的動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。以經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)PERCUTANEOUSCONARYINTERVENTIONPCI為代表的心血管介入技術(shù)給冠心病的臨床治療帶來(lái)了革命性的變化，挽救了無(wú)數(shù)人的生命，成為心血管臨床領(lǐng)域最有效的方法之一，但PCI術(shù)后再狹窄由于其發(fā)病率高，處理困難，因而嚴(yán)重影響了PCI的遠(yuǎn)期療效，盡管隨著介入技術(shù)的發(fā)展及新型藥物洗脫支架的應(yīng)用，PCI再狹窄率已有顯著降低，但仍有310％的發(fā)生率。因此，如何防止再狹窄成為冠心病治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。SCHWARTZ等研究表明，再狹窄的病理基礎(chǔ)是新生內(nèi)膜增生，而新生內(nèi)膜形成過(guò)程中，由于血管損傷，血管結(jié)構(gòu)破壞，使血管平滑肌細(xì)胞VULARSMOOTHMUSCLECELLVSMCS由中膜層向內(nèi)膜層遷移，并在包括血管緊張素ⅡANGIOTENSINⅡ，ANGⅡ在內(nèi)的多種因子作用下，發(fā)生表型變化，由收縮型轉(zhuǎn)為分泌型，并分泌大量細(xì)胞因子、炎癥因子，反過(guò)來(lái)又加速了VSMCS在局部的增殖以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成，從而最終導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄。因此，遷移增殖的VSMCS的平滑肌細(xì)胞是增厚的新生內(nèi)膜的主要組織學(xué)成分。而抑制VSMCS的遷移增殖也就成為防治再狹窄的一個(gè)重要靶點(diǎn)。ANGⅡ是一多向作用因子，它與不同的受體亞型結(jié)合產(chǎn)生不同的生物學(xué)作用，血管緊張素Ⅱ1型受體ANGⅡTYPE1RECEPT，AT1R介導(dǎo)產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)血管收縮等作用血管緊張素Ⅱ2型受體ANGⅡTYPE2RECEPT，AT2R卻與之相拮抗。由于AT2R在成年動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)較少或不表達(dá)，因此，在新生內(nèi)膜形成過(guò)程中，ANGⅡ主要通過(guò)AT1R作用導(dǎo)致和加速新生內(nèi)膜的形成。如果某種方法能夠增強(qiáng)AT2R的表達(dá)，則可通過(guò)其與AT1R相拮抗的作用來(lái)抵消AT1R的生物學(xué)效應(yīng)，從而達(dá)到抑制血管新生內(nèi)膜形成的目的。這是本課題立題的理論基礎(chǔ)。研究目的1以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白ENHANCEDGREENFLUESCENTPROTEIN，EGFP作為基因轉(zhuǎn)染示蹤物，構(gòu)建EGFPAT2R融合蛋白的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠VSMCS。2檢測(cè)AT2R基因在大鼠VSMCS中的MRNA及蛋白表達(dá)水平證實(shí)可通過(guò)真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染VSMCS并獲得較好表達(dá)率。3檢測(cè)AT2R高表達(dá)對(duì)VSMCS的增殖與凋亡的影響證實(shí)AT2R在VSMCS的表達(dá)可明顯抑制其增殖并促進(jìn)其凋亡，從而為AT2R基因治療血管再狹窄RESTENOSISRS的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。研究方法1用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMC；倒置顯微鏡行形態(tài)學(xué)觀察并使用免疫熒光法檢測(cè)ΑSMACTIN鑒定VSMCS。2以PUHD103AT2R質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增AT2R基因的全長(zhǎng)CDNA序列再將其克隆入載體PEGFPN2，構(gòu)建其真核表達(dá)載體PEGFPN2AT2R。3脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE2000對(duì)VSMCS進(jìn)行AT2R轉(zhuǎn)染；倒置熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染后VSMCS生長(zhǎng)變化，用RTPCR及WESTERNBLOT檢測(cè)AT2R在其中的表達(dá)情況。4通過(guò)MTT試驗(yàn)，檢測(cè)AT2R基因?qū)Υ笫骎SMCS增殖能力影響WESTERNBLOT檢測(cè)AT2R對(duì)VSMC的增殖細(xì)胞抗原PCNA的影響。5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AT2R基因?qū)Υ笫骎SMCS促凋亡作用。研究結(jié)果1本實(shí)驗(yàn)利用組織塊貼壁法成功地培養(yǎng)了大鼠VSMCS，并由形態(tài)學(xué)及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)證實(shí)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了平臺(tái)；2PEGFPN2AT2R成功構(gòu)建，經(jīng)測(cè)序與NCBI基因庫(kù)報(bào)道序列完全一致。3AT2R轉(zhuǎn)染VSMCS后，熒光顯微鏡下檢測(cè)其陽(yáng)性表達(dá)率大約在40％，經(jīng)RTPCR及WESTERNBLOT證實(shí)重組真核表達(dá)載體PEGFPN2AT2R轉(zhuǎn)染組的AT2R基因MRNA及蛋白表達(dá)水平高于未轉(zhuǎn)染組及PEGFPN2轉(zhuǎn)染組。4轉(zhuǎn)染AT2R基因組MTT吸光度值（0141±0015），明顯低于未轉(zhuǎn)染組（0315±0031）和PEGFPN2轉(zhuǎn)染組（0295±0023），而未轉(zhuǎn)染組和PEGFPN2轉(zhuǎn)染組之間無(wú)差異；WESTERNBLOT發(fā)現(xiàn)PEGFPN2AT2R轉(zhuǎn)染組PCNA蛋白的表達(dá)顯著低于PEGFPN2轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組，表明AT2R高表達(dá)后能夠下調(diào)PCNA蛋白表達(dá)，與MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果一致。5流式細(xì)胞術(shù)表明與未轉(zhuǎn)染組和PEGFPN2轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染AT2R基因可以促進(jìn)VSMCS早期凋亡。研究結(jié)論1真核表達(dá)載體PEGFPN2AT2R成功構(gòu)建并在VSMCS中穩(wěn)定表達(dá)2AT2R基因與VSMCS增殖能力密切相關(guān)，AT2R過(guò)表達(dá)可顯著下調(diào)PCNA蛋白表達(dá)，亦可明顯抑制VSMCS增殖活性。3流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，AT2R轉(zhuǎn)染表達(dá)后，體外培養(yǎng)的VSMCS凋亡明顯增加，這一作用對(duì)抑制VSMCS增殖是有益的。

簡(jiǎn)介：目的隨著組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，組織工程骨的出現(xiàn)為大段骨缺損修復(fù)帶來(lái)新的希望。然而，血管化問(wèn)題仍是制約組織工程骨應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵因素。支架材料作為骨組織工程的三大要素之一，對(duì)組織工程骨體內(nèi)快速血管化和新骨形成起著重要作用。因此，本研究擬制備新型促血管化支架材料并評(píng)價(jià)其體內(nèi)外生物學(xué)性能。方法1新型促血管化支架材料制備及表征①首先以可溶性鈣鹽、銅鹽、鋅鹽、磷鹽為原料，采用化學(xué)沉淀法制備缺鈣磷灰石粉體。將粉體制成漿料，以海藻酸鈣為造孔劑，經(jīng)高溫煅燒，得到摻雜銅鋅離子的雙相磷酸鈣多孔支架。根據(jù)離子摻雜含量不同CUCUZNCA摩爾比分別為0，0005，002，005，CUZN摩爾比1∶1），將得到產(chǎn)物分別定義為P0、P1、P2和P3。采用掃描電鏡SEM、X射線衍射儀XRD、紅外光譜儀FTIR、X射線光電子能譜分析儀XPS對(duì)支架形貌、晶相組成及化學(xué)成分進(jìn)行表征，萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)定其強(qiáng)度，電感耦合等離子光譜發(fā)生儀ICP檢測(cè)鈣、銅、鋅離子釋放情況。②通過(guò)乳化法合成載GDF5蛋白的PLGA微球，真空負(fù)壓法將微球與支架P2復(fù)合，獲得載GDF5的多孔支架定義為P2GDF5。采用SEM對(duì)微球形貌及其在支架上的分布進(jìn)行觀察采用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)定GDF5的釋放曲線。2新型促血管化支架材料體外生物學(xué)性能評(píng)價(jià)①將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSC和內(nèi)皮細(xì)胞EC1∶1混合后與支架共培養(yǎng)，SEM和細(xì)胞核熒光染色（DAPI）觀察細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)情況，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測(cè)ALP活性，熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)VEGF分泌水平②制備材料浸提液，分別添加等濃度CU2、ZN2的培養(yǎng)基為對(duì)照組，并與細(xì)胞共培養(yǎng)。采用上述方法檢測(cè)細(xì)胞增殖和ALP活性茜素紅染色觀察BMSC成骨和礦化MATRIGEL測(cè)定EC成血管能力。3新型促血管化支架材料體內(nèi)生物學(xué)性能評(píng)價(jià)首先構(gòu)建兔橈骨15MM缺損模型，實(shí)驗(yàn)分為五組K組不植入任何材料D組植入P0S1組植入P1S2組植入P2S3組植入P2GDF5。術(shù)后4、8、12周行X線影像學(xué)檢查，術(shù)后12周處死后，標(biāo)本包埋、切片后行HE、MASSON染色。結(jié)果1新型促血管化支架材料表征①SEM顯示支架孔徑約600～800ΜM，孔隙貫通，且隨著金屬離子含量的增加，支架表面由平滑、點(diǎn)狀顆粒、塊狀顆粒逐漸變化。XRD、FTIR和X射XPS分析顯示P0、P1和P2主要由HA和ΒTCP組成，其中P2組HATCP為3070，而P3主要為ΒTCP?？箟簭?qiáng)度測(cè)試表明隨著離子濃度由0％增加到5％，支架抗壓強(qiáng)度由151MPA小幅度降至091MPA。離子體外釋放顯示，銅、鋅離子釋放量隨添加量的增加而增加，同時(shí)鈣離子釋放速度也隨之加快。②SEM見(jiàn)GDF5PLGA微球呈球形，表面光滑，粒徑主要分布在820ΜM之間微球均勻分布在支架的孔壁上，無(wú)明顯團(tuán)聚。體外釋放示單純微球和微球在支架材料上，兩者GDF5釋放曲線相似，均實(shí)現(xiàn)平穩(wěn)釋放。2新型促血管化支架材料體外生物學(xué)性能評(píng)價(jià)①支架材料均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞能較好地粘附、生長(zhǎng)，P2GDF5支架上的細(xì)胞最多，P2次之CCK8檢測(cè)也顯示各組細(xì)胞增值良好，且P2GDF5組細(xì)胞增值明顯優(yōu)于其余三組P＜001。ALP檢測(cè)表明第14天時(shí)，P2GDF5組ALP表達(dá)水平最高，P2組次之。PCR分析顯示P2GDF5組細(xì)胞的ALP、OCN、OPN基因表達(dá)水平較其他各組明顯上調(diào)P＜005P2組細(xì)胞ALP、OCN、OSX表達(dá)水平較P0組高P＜0001。VEGF分泌量檢測(cè)示各組間均有差異P＜005，且P2GDF5組分泌水平最高。②浸提液結(jié)果表明浸提液組中細(xì)胞增殖速度最快，且ZN2組及浸提液組ALP活性明顯高于CU2組和空白組P＜001MATRIGEL成血管測(cè)試顯示CU2組和浸提液組內(nèi)皮細(xì)胞12H內(nèi)形成管腔樣結(jié)構(gòu)，而ZN2組和空白組細(xì)胞呈簇狀分布，未見(jiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)形成培養(yǎng)21天后茜素紅染色顯示，ZN2組和浸提液組鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積明顯多于空白組和銅離子組。3新型促血管化支架材料體外生物學(xué)性能評(píng)價(jià)術(shù)后動(dòng)物無(wú)死亡，所有動(dòng)物術(shù)后能正常進(jìn)食及活動(dòng)。術(shù)后4周，X線影像學(xué)顯示所有組支架材料清晰可見(jiàn)，無(wú)脫落、移位，骨缺損間隙明顯，僅S3組兩端可見(jiàn)少量低密度骨痂與材料連接術(shù)后8周，支架材料部分降解，且S1、S2和S3組材料降解量大于D組，K組和D組中新生硬化骨封閉髓腔口，斷端間暫無(wú)明顯骨性連接，S1、S2和S3均可見(jiàn)斷端部分骨性連接，骨性連接面積S3＞S2＞S1術(shù)后12周，K組斷端仍封閉，D組靠近尺骨側(cè)可見(jiàn)少量骨性連接，S1、S2、S3組骨缺損基本愈合，骨皮質(zhì)連續(xù)，部分髓腔實(shí)現(xiàn)貫通，S3修復(fù)速率明顯優(yōu)于其余各組。LANESHUX線評(píng)分結(jié)果表明，各時(shí)間點(diǎn)S3組評(píng)分最高，S2次之，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005。組織學(xué)檢測(cè)表明所有支架植入部位均未出現(xiàn)明顯炎癥、毒性和免疫排斥反應(yīng)。術(shù)后12周HE及MASSON染色顯示S1、S2、S3組均可見(jiàn)大量新生骨形成，S3組髓腔塑性較好，且新生血管數(shù)量明顯多于S1和S2組，D組可見(jiàn)部分類骨樣組織沿孔壁生長(zhǎng)，K組缺損部位為大量纖維樣組織定量統(tǒng)計(jì)分析顯示S3組新生骨面積和血管數(shù)量多于各組P＜001。結(jié)論以海藻酸鈣為造孔劑，以PLGA微球?yàn)檩d體，成功制備了具有GDF5緩釋功能的銅鋅離子共摻雜雙相磷酸鈣多孔支架。該支架具有良好的細(xì)胞相容性、成骨誘導(dǎo)性和促血管化，且能快速修復(fù)大段骨缺損，是一種具有良好臨床應(yīng)用前景的骨修復(fù)支架材料。