AT2R基因轉(zhuǎn)染表達對大鼠血管平滑肌細胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景：
　　 冠狀動脈硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)作為心血管病中發(fā)病率與死亡率均較高的心血管病之一，嚴重危害人們身體健康，而且這些年來其發(fā)病率在我國有顯著增加的趨勢，成為一個嚴重的社會問題。冠心病的發(fā)生發(fā)展過程受諸多因素影響，其中由于動脈粥樣硬化 (Atherosclerosis As) 斑塊形成造成的動脈血管壁增厚、硬化、鈣化、斑塊破裂、血栓形成，最終

2、導(dǎo)致管腔狹窄甚至閉塞，是以冠心病為代表的動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。以經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention PCI)為代表的心血管介入技術(shù)給冠心病的臨床治療帶來了革命性的變化，挽救了無數(shù)人的生命，成為心血管臨床領(lǐng)域最有效的方法之一，但PCI 術(shù)后再狹窄由于其發(fā)病率高，處理困難，因而嚴重影響了PCI的遠期療效，盡管隨著介入技術(shù)的發(fā)展及新型藥物洗脫支架的應(yīng)用，PCI 再狹窄率已有顯著降低

3、，但仍有3-10％的發(fā)生率。因此，如何防止再狹窄成為冠心病治療領(lǐng)域的研究熱點之一。
　　 Schwartz等研究表明，再狹窄的病理基礎(chǔ)是新生內(nèi)膜增生，而新生內(nèi)膜形成過程中，由于血管損傷，血管結(jié)構(gòu)破壞，使血管平滑肌細胞(vascular smooth musclecell,VSMCs)由中膜層向內(nèi)膜層遷移，并在包括血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)在內(nèi)的多種因子作用下，發(fā)生表型變化，由收縮型轉(zhuǎn)為分泌型，并分泌大量細

4、胞因子、炎癥因子，反過來又加速了VSMCs在局部的增殖以及炎癥細胞浸潤，導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成，從而最終導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄。
　　 因此，遷移增殖的VSMCs的平滑肌細胞是增厚的新生內(nèi)膜的主要組織學(xué)成分。
　　 而抑制VSMCs的遷移增殖也就成為防治再狹窄的一個重要靶點。
　　 AngⅡ是一多向作用因子，它與不同的受體亞型結(jié)合產(chǎn)生不同的生物學(xué)作用，血管緊張素Ⅱ1型受體(angⅡ type 1receptor，AT1R)介

5、導(dǎo)產(chǎn)生促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、增強血管收縮等作用, 血管緊張素Ⅱ2 型受體(angⅡ type 2 receptor，AT2R)卻與之相拮抗。由于AT2R在成年動物體內(nèi)表達較少或不表達，因此，在新生內(nèi)膜形成過程中，AngⅡ主要通過AT1R作用導(dǎo)致和加速新生內(nèi)膜的形成。如果某種方法能夠增強AT2R的表達，則可通過其與AT1R 相拮抗的作用來抵消AT1R的生物學(xué)效應(yīng)，從而達到抑制血管新生內(nèi)膜形成的目的。這是本課題立題的理論基礎(chǔ)。

6、　　 研究目的：
　　 1.以增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)作為基因轉(zhuǎn)染示蹤物，構(gòu)建EGFP-AT2R 融合蛋白的真核表達載體，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs。
　　 2.檢測AT2R基因在大鼠VSMCs中的mRNA及蛋白表達水平,證實可通過真核表達載體成功轉(zhuǎn)染VSMCs 并獲得較好表達率。
　　 3.檢測AT2R 高表達對VSMCs的增殖與凋

7、亡的影響,證實AT2R在VSMCs的表達可明顯抑制其增殖并促進其凋亡，從而為AT2R基因治療血管再狹窄(restenosis, RS)的進一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 1．用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMC；倒置顯微鏡行形態(tài)學(xué)觀察并使用免疫熒光法檢測α-SM-actin 鑒定VSMCs。
　　 2.以pUHD-10.3/AT2R 質(zhì)粒為模板，PCR 擴增AT2R基因的全長cDNA 序列, 再

8、將其克隆入載體pEGFP-N2，構(gòu)建其真核表達載體pEGFP-N2/AT2R。
　　 3.脂質(zhì)體Lipofectamine2000對VSMCs 進行AT2R 轉(zhuǎn)染；倒置熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染后VSMCs 生長變化，用RT-PCR及Western blot 檢測AT2R在其中的表達情況。
　　 4．通過MTT 試驗，檢測AT2R基因?qū)Υ笫骎SMCs 增殖能力影響, Western blot檢測AT2R對VSMC的增殖細胞抗原(

9、PCNA)的影響。
　　 5．流式細胞術(shù)檢測AT2R基因?qū)Υ笫骎SMCs 促凋亡作用。
　　 研究結(jié)果：
　　 1．本實驗利用組織塊貼壁法成功地培養(yǎng)了大鼠VSMCs，并由形態(tài)學(xué)及免疫熒光細胞化學(xué)證實，為進一步實驗提供了平臺；
　　 2．pEGFP-N2/AT2R 成功構(gòu)建，經(jīng)測序與NCBI基因庫報道序列完全一致。
　　 3.AT2R 轉(zhuǎn)染VSMCs后，熒光顯微鏡下檢測其陽性表達率大約在40％，經(jīng)R

10、T-PCR及Western blot 證實重組真核表達載體pEGFP-N2/AT2R 轉(zhuǎn)染組的AT2R基因mRNA及蛋白表達水平高于未轉(zhuǎn)染組及pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染組。
　　 4．轉(zhuǎn)染AT2R基因組MTT 吸光度值（0.141±0.015），明顯低于未轉(zhuǎn)染組（0. 315±
　　 0.031）和pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染組（0.295±0.023），而未轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染組之間無差異；Western Blot 發(fā)

11、現(xiàn)pEGFP-N2/AT2R 轉(zhuǎn)染組PCNA蛋白的表達顯著低于pEGFP-N2轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組，表明AT2R 高表達后能夠下調(diào)PCNA蛋白表達，與MTT 法檢測細胞增殖結(jié)果一致。
　　 5.流式細胞術(shù)表明與未轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染AT2R基因可以促進VSMCs 早期凋亡。
　　 研究結(jié)論：
　　 1．真核表達載體pEGFP-N2/AT2R 成功構(gòu)建,并在VSMCs中穩(wěn)定表達.
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