自噬在大鼠聽皮層退行性變過程中的作用及其相關機制研究.pdf

1、本文分為以下兩個部分:
　　第一部分:聽皮層早衰大鼠模型的建立
　　目的:通過注射D-半乳糖建立大鼠聽皮層早衰模型。
　　方法:1月齡Sprague Dawley(SD)大鼠180只，隨機分為兩組：實驗組為擬老化組，連續(xù)8周進行D-半乳糖500mg/kg/d頸背部皮下注射的處理；對照組為生理鹽水組，同樣連續(xù)處理8周，每天對大鼠進行頸背皮下注射，給予與D-半乳糖組同等體積的生理鹽水（每100g大鼠體重注射的生理鹽水體積與

2、D-半乳糖組每100g大鼠體重注射的D-半乳糖體積一樣）。注射期間注意每天對注射部位消毒處理。8周注射結束后，將D-半乳糖組和生理鹽水組再各分為3個小組，分別是3月齡組（注射結束后0個月）、9月齡組（注射結束后6個月）和15月齡組（注射結束后12個月）。每個亞組30只SD大鼠。造模結束后，對每只大鼠的聽力通過聽性腦干反應（Auditory Brainstem Response,ABR）進行檢測；大鼠聽皮層線粒體DNA的常見缺失（CD）水

3、平通過RT-PCR技術來進行檢測；大鼠聽皮層神經(jīng)元超微結構的退行性改變通過透射電鏡觀察研究；聽皮層神經(jīng)元密度的變化采用甲苯胺藍染色法觀察記錄；通過TUNEL染色以及蛋白印跡、免疫熒光法檢測聽皮層細胞凋亡水平。
　　結果：ABR檢測結果顯示聽閾隨著年齡的增長而升高，擬老化組與同月齡、相同頻率（4kHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz）的對照組比較，閾值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；D-半乳糖組mtDNA CD與同齡

4、對照組相比升高，差異具有統(tǒng)計學意義，在3、9月齡時P<0.05，15月齡時P<0.01；在對照組內(nèi)，15月齡較3月齡CD水平明顯升高（P<0.01），D-半乳糖組內(nèi)，15月齡同3月齡相比，CD水平明顯升高（P<0.01）。透射電鏡觀察結果顯示，同月齡的擬老化組與對照組大鼠相比，細胞核變形，染色質固縮，線粒體腫脹變形、數(shù)量減少，脂褐素沉積，神經(jīng)纖維脫髓鞘樣變等細胞衰老的超微結構病理變化出現(xiàn)時間較早，并且退行性變更加顯著；甲苯胺藍神經(jīng)元染色

5、結果顯示，15月齡時，擬老化組大鼠與自然老化組大鼠相比，聽皮層神經(jīng)元密度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；TUNEL染色以及Western blotting、免疫熒光結果表明，擬老化組大鼠聽皮層TUNEL陽性數(shù)目以及Cleaved CASP3蛋白表達水平與同月齡的自然老化組大鼠聽皮層相比，在3月齡時無明顯差異，但是在9、15月齡時，細胞凋亡水平明顯增加。
　　結論:D-半乳糖長期慢性處理導致大鼠聽皮層線粒體DNA常見缺

6、失累積；聽皮層神經(jīng)元密度下降、神經(jīng)元細胞超微結構退行性變過早出現(xiàn)；聽皮層細胞凋亡水平升高。D-半乳糖加速了聽皮層細胞衰老的進程，促進了老年性聾的發(fā)生。
　　第二部分:觀察大鼠聽皮層中自噬水平隨著年齡的變化及自噬在聽皮層衰老中的作用并探討AMPK-mTOR-ULK1信號通路對自噬的調控機制
　　目的:老年性聾已成為嚴重影響老年人生活質量的重要疾病因素之一，但是到目前為止老年性聾的發(fā)病機制尚不清楚。自噬已被證實在多種疾病中的發(fā)生

7、發(fā)展過程中起到重要作用，近年來自噬在神經(jīng)退行性疾病中的研究越老越多，但在中樞性老年性聾方面卻未見相關研究。本研究的目的是觀察自噬在大鼠聽皮層的退化過程中的變化及其作用，以及對自噬相關調控機制的研究。
　　方法：1月齡SD大鼠180只隨機分為兩組：其中實驗組大鼠連續(xù)8周給予頸背皮下注射D-半乳糖500mg/kg/d；對照組為生理鹽水組，同樣連續(xù)處理8周，每天對大鼠進行頸背皮下注射，注射劑量根據(jù)體重計算，體積同D-半乳糖。注射期間注意

8、每天對注射部位消毒處理。8周注射結束后，將D-半乳糖組和生理鹽水組再各分為3個小組，分別是3月齡組（注射結束后0個月）、9月齡組（注射結束后6個月）和15月齡組（注射結束后12個月）。實時定量PCR檢測自噬相關基因LC3、BECN1和凋亡相關基因BAX，BCL-XL，BCL2的mRNA表達水平；Western blotting檢測LC3、BECN1、p62、BAX、BCL-XL、BCL2和AMPK-mTOR-ULK1信號通路相關蛋白P-

9、AMPK、P-mTOR、P-ULK1、Atg13、P-4EBP1、Atg5、Atg7的蛋白表達；免疫熒光技術檢測LC3、BECN1、p62和BCL2在聽皮層的定位及表達水平的變化。
　　結果：對自噬相關基因及凋亡相關基因mRNA通過RT-PCR檢測表明，與自然老化組相比，擬老化組LC3mRNA水平在3月齡、9月齡分別上升了1.52倍（P<0.05）和1.64倍（P<0.05）；BECN1mRNA水平在3月齡上升了1.84倍（P<0

10、.05）；在15月齡，和自然老化組相比，擬老化組LC3、BECN1mRNA水平分別下降了1.35倍（P<0.05）和1.21倍（P<0.05）；促凋亡基因BAX在9、15月齡mRNA分別上升了1.45倍（P<0.05）和1.70倍（P<0.01）；抗凋亡基因BCL-XL在3月齡升高了1.47倍（P<0.05），在15月齡降低了0.76倍（P<0.05）；BCL2在3月齡、9月齡分別升高了1.94倍（P<0.01）和1.6倍（P<0.05

11、），在15月齡降低了2.1倍（P<0.01）。Western blotting結果顯示，較同齡對照組相比，擬老化組聽皮層自噬相關蛋白LC3-II在3月齡、9月齡分別升高了2.56倍（P<0.05），1.93倍(P<0.05)；在15月齡下降了1.96倍(P<0.01)。BECN1在3月齡升高了1.74倍(P<0.01)；在15月齡下降了1.24倍(P<0.05)。較同齡對照組相比，自噬降解底物p62在擬老化組3、9月齡明顯降低，分別下降

12、了2.41，1.75倍，在15月齡升高了1.20倍。此外，和同齡自然老化組相比，擬老化組促凋亡蛋白BAX在9、15月齡分別上升了1.8倍（P<0.05）和5.86倍(P<0.001)?？沟蛲龅鞍譈CL2在擬老化組大鼠聽皮層表達水平在3月齡和9月齡均明顯升高，分別升高了2.4倍（P<0.001）和2.36倍(P<0.01)；在15月齡時，擬老化組BCL2明顯下降，下降了3.67倍(P<0.001)。抗凋亡蛋白BCL-XL在3月齡時擬老化組

13、較對照組升高了1.5倍（P<0.05），15月齡時，下降了1.9倍（P<0.05）。此外，較對照組相比，BCL-XL/BAX在擬老化組3月齡上升了1.83倍（P<0.05），在9月齡、15月齡分別下降了1.67倍（P<0.05），8.3倍（P<0.001）；BCL2/BAX在3月齡明顯上升了3.4倍（P<0.01），在15月齡明顯降低了10.6倍（P<0.001）。Western blotting對AMPK-mTOR-ULK1信號通路相

14、關蛋白檢測表明,與同齡對照組相比，擬老化組P-AMPK在3月齡升高了1.47倍（P<0.01）,在9月齡、15月齡分別降低了6.64倍（P<0.001）和6.05倍（P<0.001）；P-mTOR和P-ULK1在3月齡分別降低了1.33倍（P<0.05）和2.02倍（P<0.001）,在9月齡分別升高了5.05倍（P<0.001）和1.36倍（P<0.01），在15月齡分別升高了1.75倍（P<0.01）和1.26倍（P<0.05）；A

15、tg13在3月齡、9月齡分別升高了1.13倍（P<0.05）和2.24倍（P<0.01），在15月齡降低了1.35倍。免疫熒光結果顯示，LC3和BECN1蛋白表達量在3月齡擬老化組較同齡對照組明顯升高(P<0.001,P<0.01)，在15月齡時明顯降低(P<0.001,P<0.01)；較同齡對照組相比，擬老化組p62在3月齡明顯降低（P<0.01），在15月齡明顯升高（P<0.01）；BCL2在3月齡(P<0.01)、9月齡(P<0.

16、05)擬老化組較同齡對照組均明顯升高，15月齡時較對照組明顯降低（P<0.001）。此外，Western blotting結果表明，在本實驗中，4EBP1活性與自噬活性的改變沒有明顯相關性。
　　結論：自噬水平在大鼠聽皮層隨著年齡的增長而改變，從青年到中年，自噬水平呈現(xiàn)升高的趨勢，到老年時下降，并且和抗凋亡蛋白BCL2、BCL-XL協(xié)同抵抗細胞凋亡。在D-半乳糖誘導的擬老化組，3月齡時，自噬水平代償性升高，起到了保護作用；9月齡時