乙酰膽堿M受體調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞免疫應(yīng)答作用研究.pdf

1、阿爾茲海默癥（AD）是發(fā)生在老年期及老年前期的一種慢性退化性腦變疾病，以進(jìn)行性記憶減退、認(rèn)知障礙、人格改變?yōu)榕R床表現(xiàn)。在人口老齡化的當(dāng)代社會(huì)，AD成為繼心腦血管疾病，腫瘤和腦卒中的第四大殺手，威脅著老年人身體健康，降低了生活質(zhì)量，加重家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。AD發(fā)病原因復(fù)雜多樣，目前具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。
　　近年研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥反應(yīng)是AD的一個(gè)重要的致病原因。AD患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞（MG）高度活化，炎性因子含量增高。作為神經(jīng)炎性的始作

2、俑者，MG免疫功能的調(diào)控成為AD治療的新靶點(diǎn)，其免疫功能的研究也躋身于神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。MG在CNS中的作用是把雙刃劍，激活的MG吞噬細(xì)胞殘?jiān)?，通過抗原遞呈功能、細(xì)胞因子分泌參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，移除病原體。然而，MG過度激活導(dǎo)致CNS發(fā)生慢性炎癥，加重大腦損傷。因此，嚴(yán)格調(diào)控MG免疫反應(yīng)是防止神經(jīng)炎性發(fā)生的關(guān)鍵。
　　乙酰膽堿是一類參與中樞大腦學(xué)習(xí)、認(rèn)知、記憶等的重要神經(jīng)遞質(zhì)，乙酰膽堿作用的受體包括毒蕈堿型膽堿受體（mA

3、ChRs）和煙堿型膽堿受體（nAChRs）。近年來研究表明，乙酰膽堿系統(tǒng)中nAChRs在MG介導(dǎo)的神經(jīng)炎性發(fā)揮作用，а7煙堿型受體（а7nAChR）在MG表達(dá)，激活а7nAChR抑制MG的炎性反應(yīng)。然而，mAChRs在MG的表達(dá)情況以及是否參與MG的炎性調(diào)控尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠長期腹腔注射mAChRs非選擇性拮抗劑鹽酸苯海索（THP）促進(jìn)大腦海馬和皮層的MG增生和激活，上調(diào)MG的CD68表達(dá)同時(shí)伴隨M1受體表達(dá)增加，

4、并且兩者存在共定位，暗示M受體介導(dǎo)THP對(duì)MG活化的調(diào)控作用。在本研究中，將首次確證mAChRs在MG的表達(dá)情況，并且觀察mAChRs對(duì)MG免疫應(yīng)答功能的調(diào)控作用。本研究的開展利于探討mAChRs與神經(jīng)炎性的關(guān)系，開拓了其影響AD發(fā)展的新機(jī)制研究,有利于尋找治療AD的新靶點(diǎn)。
　　首先建立原代大鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法，在體外條件下，確證mAChRs在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況；利用mAChRs非選擇性激動(dòng)劑氧化震顫素（OX）、mAChR

5、s非選擇拮抗劑阿托品和M1受體阻斷劑毒蕈堿毒素7（MT7）三種工具藥，研究mAChRs對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞抗原遞呈功能、小膠質(zhì)細(xì)胞活化和免疫炎癥介質(zhì)釋放的調(diào)控作用。
　　方法：
　?。?）建立大鼠皮層原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法：將出生12 h內(nèi)的SD大鼠的皮層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)8-9天，小膠質(zhì)細(xì)胞分層明顯且數(shù)量達(dá)到最多，利用胰酶溫和消化法和震搖法進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化；純化的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)3天后基本恢復(fù)靜息狀態(tài)，通過小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子

6、Iba1免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。
　?。?）mAChRs在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)研究：利用RT-PCR、Western-blot技術(shù)從mRNA和蛋白水平檢測mAChRs在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況。
　　（3）mAChRs對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞抗原遞呈功能影響研究：mAChRs非選擇性激動(dòng)劑OX處理小膠質(zhì)細(xì)胞，利用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）結(jié)合免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)觀察OX對(duì)主要組織相容性抗原分子Ι（MHCΙ）表達(dá)影響；熒光定量PCR檢測OX對(duì)小膠

7、質(zhì)細(xì)胞抗原遞呈分子相關(guān)基因Rt1-Aw2、β2m和Tap1 mRNA表達(dá)影響。
　?。?）M1受體參與mAChRs調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞抗原遞呈作用研究：利用M1受體阻斷劑MT7，應(yīng)用免疫熒光結(jié)合CLSM、Western-blot和熒光定量PCR檢測MT7對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞MHCΙ分子和M1受體表達(dá)的變化。
　?。?）mAChRs對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響：免疫熒光結(jié)合CLSM和Western-blot檢測OX單獨(dú)給藥以及MT7和OX伴隨給藥

8、對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活分子CD68和CD11b表達(dá)影響。
　　（6）mAChRs對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放影響：Luminex技術(shù)檢測OX對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、TNF-а和IL-10釋放的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）改進(jìn)了原代小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1陽性率高達(dá)95％；觀察了小膠質(zhì)細(xì)胞生長規(guī)律，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)阿米巴樣，分離純化3天后基本恢復(fù)分枝狀；
　　（2）RT-PCR結(jié)果表明，

9、mAChRs五種亞型受體mRNA均在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，免疫熒光結(jié)合CLSM分析和Western-blot結(jié)果顯示M1受體表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，并且定位在胞膜和胞漿；
　?。?）免疫熒光結(jié)合CLSM分析發(fā)現(xiàn)，正常組小膠質(zhì)細(xì)胞MHCΙ表達(dá)量較少，OX（10-5 M）與小膠質(zhì)細(xì)胞共同孵育72 h，MHCΙ表達(dá)顯著上調(diào)；
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，正常組小膠質(zhì)細(xì)胞膜共標(biāo)記MHCΙ和β2m的細(xì)胞陽性率為8.46±0.47%，OX組β2m

10、和MHCΙ共標(biāo)記細(xì)胞陽性率為51.80±1.48%，與正常組比較，OX組顯著增加了5倍，表明OX促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞膜功能性MHCΙ表達(dá)；
　　（5）熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OX促進(jìn)抗原遞呈分子相關(guān)基因Rt1-Aw2、β2m和Tap1 mRNA表達(dá)；
　?。?）免疫熒光結(jié)合CLSM分析表明，OX（10-5 M，40 min）同時(shí)上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞MHCΙ和M1受體表達(dá)，MT7（10-8 M）預(yù)處理小膠質(zhì)5 min，部分阻斷OX誘導(dǎo)的M

11、HCΙ和M1受體表達(dá)；并且M1受體與MHCΙ存在共定位，提示M1受體參與OX上調(diào)MHCΙ表達(dá)；
　?。?）OX動(dòng)態(tài)影響小膠質(zhì)細(xì)胞M1受體表達(dá)：CLSM結(jié)合Western-blot結(jié)果顯示， OX（10-5M，72 h）上調(diào)M1受體表達(dá);熒光定量PCR結(jié)果表明，OX（10-5M，20 min）抑制M1受體mRNA表達(dá), OX（40 min和72 h）促進(jìn)M1受體mRNA表達(dá)，MT7部分阻斷OX誘導(dǎo)的M1受體mRNA表達(dá)；
　　

12、（8）CLSM分析和western-blot結(jié)果顯示，OX（10-5 M，72 h）上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞激活分子CD68和CD11b表達(dá)，表明OX促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化；MT7部分阻斷OX對(duì)兩者表達(dá)的誘導(dǎo)作用；提示M1受體直接調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化;
　?。?）OX（10-6 M，10-4 M）與小膠質(zhì)細(xì)胞共同孵育24 h，小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-а和IL-10釋放減少，OX對(duì)IL-1β釋放無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　（1）成功改進(jìn)了原