DC-CIK逆轉卵巢癌耐藥細胞SKOV3-DDP多藥耐藥的研究.pdf

1、目的：腫瘤細胞減滅術聯(lián)合以鉑類藥物為主的化療是目前卵巢癌最常用的臨床治療方案，但是多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）的出現(xiàn)往往影響卵巢癌的化療效果，DC-CIK療法是過繼性細胞免疫療法（adoptive cellular immunotherapy, ACI）之一，有研究表明DC-CIK不僅對血液腫瘤和多種實體腫瘤細胞有殺傷作用，還可以增加腫瘤耐藥細胞對化療藥物的敏感性，下調耐藥基因MDR1的表達。本研究通過

2、體外培養(yǎng)的樹突狀細胞（dendritic cells, DC）聯(lián)合細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer, CIK）作用于卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP，觀察DC-CIK對SKOV3/DDP細胞的逆轉耐藥作用及對耐藥基因MDR1表達量的影響。
　　方法：
　　1.采集健康人外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC），在體外用重組人干擾

3、素-γ（Recombinant Human interferon-γ, rhIFN-γ）、CD3單克隆抗體（CD3 monoclonal antibody, CD3McAb）、重組人白介素-2（Recombinant Human interleukine-2, rhIL-2）、重組人白介素-1α（Recombinant Human interleukine-1α, rhIL-1α）作用下誘導非貼壁細胞成CIK細胞，用重組人白介素-4（R

4、ecombinant Human interleukine-4, rhIL-4）、重組人粒細胞集落刺激因子(Recombinant Human granulocyte-macrophage CSF, rhGM-CSF)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)作用下誘導培養(yǎng)貼壁細胞成DC細胞。將DC與CIK細胞共培養(yǎng)后，利用相差倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，并采用流式細胞技術（Flow Cytometr

5、y, FCM）檢測CIK細胞的免疫表型CD3+CD56+及DC細胞免疫表型CD83+、CD86+的表達情況。
　　2.采用CCK法分別檢測CIK細胞和DC-CIK細胞在效靶比為2.5:1、5:1、10:1、20:1、40:1時對SKOV3/DDP細胞24h的抑制率，計算出CIK細胞及DC-CIK細胞對SKOV3/DDP作用24h后的非細胞毒性濃度IC10。
　　3.采用CCK法檢測順鉑對不同組靶細胞SKOV3/DDP的抑制作

6、用，設順鉑濃度為1 ug/ml、2 ug/ml、4 ug/ml、8 ug/ml、16 ug/ml、32 ug/ml，靶細胞SKOV3/DDP分為3組，對照組為SKOV3/DDP組，實驗組1為經非細胞毒性濃度 IC10的CIK干預后的SKOV3/DDP細胞組（SKOV3/DDP+CIK），實驗組2為經非細胞毒性濃度IC10的DC-CIK干預后的SKOV3/DDP細胞組（SKOV3/DDP+DC-CIK），計算順鉑對各組SKOV3/DDP細

7、胞的半數抑制濃度IC50，以判斷CIK和DC-CIK細胞能否增加耐藥細胞株SKOV3/DDP對順鉑的敏感性。
　　4.采用實時熒光定量PCR分別檢測SKOV3細胞組、SKOV3/DDP細胞組、SKOV3/DDP+CIK細胞組、SKOV3/DDP+DC-CIK細胞組的耐藥基因MDR1表達量的變化。
　　結果：
　　1.成功分離出PBMC并誘導培養(yǎng)出成熟DC及CIK細胞，于相差倒置顯微鏡下觀察，可見CIK細胞大量擴增，部分

8、細胞呈集落樣生長，DC細胞呈現(xiàn)出成熟DC細胞典型的毛刺樣突起。應用流式細胞技術檢測出DC細胞表面有（55.66±5.13）％表達成熟DC特異性表面標志CD83+，有（91.70±3.09）%表達CD86+，CIK細胞的CD3+CD56+雙陽性率達（56.63±6.21）%，提示大部分DC及CIK已成熟；
　　2.在效靶比為2.5:1、5:1、10:1、20:1、40:1作用下，CIK細胞對卵巢癌耐藥株 SKOV3/DDP24h的抑

9、制率分別為（4.33±0.31）%、（8.03±0.57）%、（15.60±0.79）%、（22.14±0.61）%、（38.60±0.40）%， DC-CIK細胞對 SKOV3/DDP的抑制率分別為（5.30±0.26）%、（9.97±0.31）%、（19.67±0.47）%、（32.20±0.58）%、（49.40±0.28）%，結果顯示隨著效靶比的增加，CIK細胞及DC-CIK細胞對SKOV3/DDP的殺傷力逐漸增強，兩組在2.5

10、:1、5:1時抑制率與對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05），在10:1、20:1、40:1時抑制率與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且在同一效靶比下，同源的DC-CIK細胞比CIK細胞的殺傷作用大，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；通過線性回歸計算出CIK和DC-CIK對SKOV3/DDP的IC10分別為7.68:1和5.75:1，根據文獻，研究某方法或藥物逆耐藥作用時一般選取略小于IC10的劑量，因此本實驗選取

11、CIK細胞及DC-CIK細胞對SKOV3/DDP作用的效靶比為5:1；
　　3.CCK法檢測順鉑對不同組SKOV3/DDP細胞的抑制作用，CIK及DC-CIK細胞效靶比為5:1，聯(lián)合作用于SKOV3/DDP細胞24h后，算得順鉑對SKOV3/DDP細胞的IC50由22.33ug/ml分別降至14.31ug/ml、11.39ug/ml，逆轉耐藥倍數分別為1.56倍和1.96倍，增加了SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性；
　　

12、4.實時熒光定量PCR檢測各組靶細胞中耐藥基因MDR1的表達水平，2-△△Ct法計算相對表達量，以卵巢癌非耐藥株SKOV3為對照組，表達量為1，耐藥株 SKOV3/DDP的MDR1呈高表達，表達量為（21.498±3.744），經過CIK細胞及DC-CIK細胞作用后，MDR1表達量均下降，分別為（11.248±3.806）、（7.554±1.821），SKOV3/DDP+DC-CIK細胞組MDR1下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0

13、5）。
　　結論：
　　1.健康人外周血來源的PBMC經過相應的細胞因子誘導及培養(yǎng)后，可以獲得成熟DC細胞和大量增殖的CIK細胞，選用流式細胞術檢測細胞的免疫表型，鑒定CIK細胞及DC細胞方法簡單、可靠。
　　2.CIK細胞及DC-CIK細胞對卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP均有殺傷作用，并且在一定范圍內，效靶比越大，效應細胞的殺傷力越大；同一效靶比下，與DC共培養(yǎng)后的DC-CIK細胞比CIK細胞殺傷作用更強， DC