載siRNA納米復(fù)合物的構(gòu)建和體外評(píng)價(jià).pdf

1、目的：
　　近年來，RNA干擾在基因功能和基因治療方面的研究較為廣泛，已逐漸發(fā)展為一種較成熟的技術(shù)。RNA干擾是一種特異性細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄機(jī)制，通過誘發(fā)相應(yīng)mRNA的酶降解發(fā)揮基因沉默作用。雙鏈小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）是RNA干擾的效應(yīng)分子之一，理論上可抑制任何靶基因表達(dá)，已被列為基因型疾病的潛在治療劑。但是，裸露的siRNA進(jìn)入血清易被核酸酶降解，且siRNA帶負(fù)電荷，親水性強(qiáng)，導(dǎo)致其不易

2、透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮高效的RNAi作用。因此，siRNA應(yīng)用的關(guān)鍵在于尋找安全、有效的遞送載體。目前已有很多載體用于改善siRNA的核酸酶抗性而又不干擾其沉默效率。其中，細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）作為基因遞送載體被廣泛研究且表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞穿膜肽通常由5~30個(gè)氨基酸構(gòu)成，是一類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的陽離子或兩親性短肽。它可將不同的貨物分子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞和組織中而不引起顯著毒副作

3、用。
　　本文擬構(gòu)建一種可以包載核酸類藥物siRNA并提高其轉(zhuǎn)染效果的納米復(fù)合物。首先選取細(xì)胞穿膜肽中的八聚精氨酸（R8）作為siRNA的基本載體，采用硬脂酸和聚乙二醇對(duì)其進(jìn)行修飾，合成出幾種載體材料。再將載體材料與siRNA孵育制備成納米復(fù)合物。然后，通過納米粒度和zeta電位分析儀及瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)考察納米復(fù)合物的理化性質(zhì)和包載能力，從而篩選出能夠縮合并遞送siRNA入胞的復(fù)合物。最后，以MCF-7、A549為模型細(xì)胞進(jìn)行細(xì)

4、胞攝取試驗(yàn)，通過與市售產(chǎn)品（Lipofectamine2000）作比較，考察自制復(fù)合物介導(dǎo)siRNA入胞的效果。
　　方法：
　　1.載體合成：首先，合成SA-R8。先制備SA活化反應(yīng)液，再取SA活化液加入到R8溶液中反應(yīng)30min，然后將反應(yīng)液以純凈水為透析液透析24 h，透析結(jié)束后取少量透析液進(jìn)行質(zhì)譜分析。接著，用合成的SA-R8與mPEG2000-Mal和mPEG5000-Mal反應(yīng)合成SA-R8-PEG，同樣將反應(yīng)液

5、以純凈水為透析液透析純化，然后取適量透析液質(zhì)譜檢測(cè)。
　　2.復(fù)合物制備及評(píng)價(jià)：合成的載體材料具備兩親性，在極性溶劑中能自組裝成納米粒；八聚精氨酸（R8）帶正電荷，可通過靜電相互作用縮合帶負(fù)電荷的siRNA?；谝陨显?，首先，用DEPC水溶解載體材料使自組裝成空白納米粒，隨后加入藥物siRNA渦旋靜置，制備載siRNA的納米復(fù)合物。然后，通過納米粒度和zeta電位分析儀對(duì)復(fù)合物的粒徑、電位進(jìn)行測(cè)定。接著，通過瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)對(duì)

6、復(fù)合物包載siRNA的能力進(jìn)行考察。根據(jù)考察結(jié)果，篩選出粒徑、電位合適且能夠完全包載siRNA的復(fù)合物。最后，以MCF-7和A549兩種細(xì)胞為模型細(xì)胞，將篩選出的最佳復(fù)合物與游離siRNA和市售產(chǎn)品（Lipofectamine2000）一同給藥進(jìn)行細(xì)胞攝取試驗(yàn)，通過流式細(xì)胞分析儀定量檢測(cè)及評(píng)價(jià)自制復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。
　　結(jié)果：
　　質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果顯示，合成的SA-R8、SA-R8-PEG2000和SA-R8-PEG5000

7、實(shí)際分子量與理論值一致或相近；復(fù)合物(SA-R8/SA-R8-PEG200020％)/siRNA的平均粒徑在300~400nm之間，復(fù)合物(SA-R8/SA-R8-PEG500020%)/siRNA平均粒徑在500~800nm之間，隨著N/P比的增大，兩者zeta電位從負(fù)變?yōu)檎?；瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)顯示，兩種復(fù)合物(SA-R8/SA-R8-PEG200020%)/siRNA和(SA-R8/SA-R8-PEG500020%)/siRNA均在

8、N/P比為20:1時(shí)完全包載siRNA；細(xì)胞攝取試驗(yàn)分析顯示兩種納米復(fù)合物能夠成功地將siRNA轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞；且自制載體SR/SRP2K介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞能力與市售產(chǎn)品（Lipofectamine2000）不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.本文成功合成了載體材料SA-R8-PEG2000和SA-R8-PEG5000，且方法簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性較好。
　　2.通過靜電相互作用成功制備了載siRNA

9、的納米復(fù)合物，且方法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性較好。通過粒徑、電位的測(cè)定及凝膠電泳試驗(yàn)證明復(fù)合物能夠成功包載模型藥物siRNA。
　　3.細(xì)胞攝取試驗(yàn)表明，相比游離siRNA，當(dāng)N/P為20:1時(shí)，兩種復(fù)合物(SA-R8/SA-R8-PEG200020%)/siRNA和(SA-R8/SA-R8-PEG500020%)/siRNA明顯提高了siRNA的細(xì)胞攝??；且自制載體SR/SRP2K（載體SA-R8/SA-R8-PEG200020%的縮寫