MiR-1275通過上調IGF-1R及CCR7的表達從而促進頭頸鱗癌的增殖、遷移及侵襲能力.pdf

1、目的：頭頸鱗癌是頭頸部常見的起源于皮膚及黏膜上皮襯里的高侵襲性惡性腫瘤。由于頭頸鱗癌在腫瘤生物學行為上具有的強局部侵襲能力及易向周圍及遠處淋巴結轉移的特點，導致了頭頸鱗癌患者預后較差，使其總體五年生存率持續(xù)較低。近些年來，隨著有關于頭頸鱗癌中異常表達的miRNA與頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展關系的研究報道大量出現(xiàn)，為我們深入了解頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了巨大幫助。但是對于一些miRNA在頭頸鱗癌中發(fā)揮的具體作用及作用方式，我們的了解仍然具有一

2、定的局限性。miRNA是非編碼蛋白質的單鏈小RNA分子，它可以與目標mRNA的3'端非編碼區(qū)域結合發(fā)揮作用，通過降解目標mRNA或抑制mRNA的翻譯從而調控基因的表達量。已證明miRNA可以參與許多疾病的發(fā)展過程，特別是惡性腫瘤。然而，目前雖然已有許多研究證實了在多種疾病中miR-1275的表達量異常，但是有關于miR-1275在頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中起何種作用的信息仍十分有限，因此miR-1275在惡性腫瘤特別是頭頸鱗癌中發(fā)揮的具體作

3、用及作用方式還需要我們進一步的研究。IGF-1R在已發(fā)表的研究中被證明在頭頸鱗癌中高表達，且通過實驗驗證了其在頭頸鱗癌細胞中可以通過激活PI3K/AKT信號通路從而提高頭頸鱗癌的轉移能力。課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)了CCR7在頭頸鱗癌中的高表達趨勢，證明CCR7同樣可以激活PI3K/AKT信號通路從而參與調控頭頸鱗癌的淋巴結轉移過程。PI3K/AKT信號通路在頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中所起到的重要作用已經被研究者廣泛認同。
　　方法：

4、⑴使用實時熒光定量PCR技術(Real Time PCR)檢測頭頸鱗癌病灶組織及頭頸鱗癌細胞中miR-1275的表達量。⑵利用從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取的頭頸鱗癌患者的臨床數(shù)據(jù)以及他們的miR-1275表達譜數(shù)據(jù)，對表達有miR-1275的頭頸鱗癌患者進行生存分析。⑶使用能夠過表達miR-1275的mimics質粒及能夠抑制miR-1275表達的inhibitor片段，通過瞬時轉染技術將它們導入頭頸鱗癌細胞，達到調控頭頸鱗癌細胞中miR-1

5、275表達量的目的。通過細胞功能實驗（劃痕實驗、Transwell實驗和CCK8實驗）驗證miR-1275在頭頸鱗癌細胞中所起的作用。各項實驗按照研究目的均分為五組，即空白對照組、miR-1275過表達組、過表達陰性對照組、miR-1275抑制表達組及抑制表達陰性對照組。⑷利用Western blot實驗檢測轉染mimics質粒及inhibitor片段后的頭頸鱗癌細胞中預測靶基因的蛋白表達量的變化情況。
　　結果：①在15對頭頸鱗

6、癌臨床標本的實時熒光定量PCR檢測數(shù)據(jù)結果中（取自15名患者，其中15例頭頸鱗癌病灶組織，15例對應的癌旁正常組織），我們發(fā)現(xiàn)了相較于癌旁正常組織，頭頸鱗癌病灶組織中的miR-1275表達量有所上調，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。依據(jù)頭頸鱗癌細胞的實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)結果顯示，miR-1275在PCI-37A/37B及PCI-4A/4B四種頭頸鱗癌細胞中均可被檢測出（A:取自于頭頸鱗癌患者的原發(fā)病灶，B:取自于同一患者的轉移淋巴

7、結組織）。其中PCI-37B中miR-1275的表達量顯著高于PCI-37A，而PCI-4B中的miR-1275表達量也同樣高于PCI-4A，以上差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。我們依據(jù)這些數(shù)據(jù)結果推斷miR-1275在頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到了重要作用。②使用過表達miR-1275的mimics質粒、抑制miR-1275表達的inhibitor片段以及它們各自對應的陰性對照，分別轉染頭頸鱗癌細胞（PCI-37B）。利用實時

8、熒光定量PCR技術，證實了分別轉染過表達質粒及抑制表達片段后的頭頸鱗癌細胞中miR-1275的表達量顯著上升和下調，轉染陰性對照的兩組頭頸鱗癌細胞中的miR-1275表達量無明顯改變。③通過CCK8實驗驗證miR-1275對頭頸鱗癌細胞增殖能力的影響，依據(jù)CCK8實驗的結果數(shù)據(jù)制成標準曲線。按照標準曲線趨勢得出結論，抑制頭頸鱗癌細胞中miR-1275的表達可以降低細胞的增殖能力，增加細胞中miR-1275的表達量可以促進細胞的增殖能力。

9、證明miR-1275可以促進頭頸鱗癌細胞的增殖能力。④通過劃痕實驗及transwell遷移實驗檢測轉染后的頭頸鱗癌細胞遷移能力的改變。抑制頭頸鱗癌細胞中miR-1275的表達量后，可以發(fā)現(xiàn)細胞的遷移能力顯著降低;而上調miR-1275的表達量后，細胞遷移能力則顯著提升。結果證明了miR-1275的表達量與頭頸鱗癌細胞的遷移能力呈正相關趨勢。⑤使用Transwell侵襲實驗探究miR-1275對頭頸鱗癌細胞侵襲能力的影響。可以發(fā)現(xiàn)抑制頭頸

10、鱗癌細胞中miR-1275的表達量后，細胞的侵襲能力顯著下降;而上調細胞中miR-1275表達量后，細胞的侵襲能力顯著上升。這說明miR-1275可以促進頭頸鱗癌細胞的侵襲能力。⑥從TCGA數(shù)據(jù)庫中查詢到頭頸鱗癌患者的臨床數(shù)據(jù)以及其miR-1275的表達譜數(shù)據(jù)。利用ROC曲線獲得分組臨界值，根據(jù)該值將表達有miR-1275的頭頸鱗癌患者分為兩組。制作KM曲線并使用Log Rank檢驗獲取顯著性P值。我們發(fā)現(xiàn)了這樣的趨勢，即miR-127

11、5表達量低的頭頸鱗癌患者生存時間長于miR-1275表達量高的患者。⑦為了明確miR-1275參與頭頸鱗癌轉移過程的作用機制，我們利用Westernblot實驗檢測miR-1275能否通過調控IGF-1R及CCR7的蛋白表達量，參與調控頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程。通過轉染技術抑制頭頸鱗癌細胞中miR-1275的表達量后，我們發(fā)現(xiàn)IGF-1R及CCR7的蛋白表達量顯著下降;而上調miR-1275的表達量后，IGF-1R及CCR7的蛋白表達量顯

12、著提高。據(jù)此我們可以合理推測，miR-1275可以通過增加IGF-1R及CCR7的蛋白表達量從而促進頭頸鱗癌細胞的遷移、侵襲及增殖能力。
　　結論：⑴相較于癌旁正常組織及轉移能力低的頭頸鱗癌細胞，miR-1275在頭頸鱗癌病灶組織及轉移能力高的頭頸鱗癌細胞中表達量有所上調。⑵生存分析結果提示，miR-1275表達量低的頭頸鱗癌患者的生存時間可能更長。⑶miR-1275可以起到類似于癌基因的作用從而促進頭頸鱗癌細胞的侵襲、遷移及增殖