櫛孔扇貝(Chlamys farreri)性類(lèi)固醇激素和17β-羥類(lèi)固醇脫氫酶8在性腺發(fā)育過(guò)程中的潛在作用.pdf

1、研究表明性類(lèi)固醇激素廣泛地存在于軟體動(dòng)物中,并在軟體動(dòng)物生殖過(guò)程中發(fā)揮著潛在的重要作用,但是目前對(duì)軟體動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)的了解還十分有限,而且在軟體動(dòng)物性類(lèi)固醇激素的來(lái)源和功能機(jī)制等問(wèn)題上還存有爭(zhēng)議。
　　櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是一種雌雄異體、性別穩(wěn)定的雙殼貝類(lèi),是我國(guó)北方重要的經(jīng)濟(jì)物種。本研究以櫛孔扇貝為研究對(duì)象,首先檢測(cè)了櫛孔扇貝年生殖周期性腺中雌二醇和睪酮的含量逐月變化,探討了性類(lèi)固醇激素在櫛孔扇貝生殖過(guò)程中

2、的潛在作用;克隆并鑒定出了17β-羥類(lèi)固醇脫氫酶8(17β-HSD8)基因,并對(duì)其序列特征和體外催化活性進(jìn)行了分析;進(jìn)一步,研究分析了17β-HSD8在櫛孔扇貝性腺和胚胎、幼蟲(chóng)中的時(shí)空表達(dá)模式,并探討了其在性類(lèi)固醇激素合成代謝途徑、配子發(fā)生和個(gè)體早期發(fā)育過(guò)程中的潛在作用。
　　為了探討性類(lèi)固醇激素在櫛孔扇貝生殖過(guò)程中的潛在作用,本文通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)檢測(cè)并分析了2012年1月到12月期間櫛孔扇貝性腺中雌二醇和睪酮含

3、量的變化。根據(jù)配子發(fā)生和排放過(guò)程的組織學(xué)特征,我們將櫛孔扇貝性腺年生殖周期劃分為休止期、增殖期、生長(zhǎng)期、成熟期、第一次排放期、恢復(fù)期和第二次排放期共七個(gè)時(shí)期。在櫛孔扇貝年生殖周期過(guò)程中,性腺中雌二醇含量變化范圍是75.07 pg/g~666.24 pg/g,而睪酮含量變化范圍是91.09 pg/g~506.28 pg/g。櫛孔扇貝卵巢中雌二醇的含量全年高于精巢雌二醇含量,而精巢中睪酮的含量在配子發(fā)生階段高于卵巢睪酮含量。卵巢中雌二醇的含

4、量和精巢中睪酮的含量均隨著配子發(fā)生而升高,在配子排放前達(dá)到最高值,并在配子排放后迅速下降。櫛孔扇貝卵巢中雌二醇含量和卵徑具有正相關(guān)性(r=0.743,P<0.05, n=25),表明雌二醇可能在卵子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。櫛孔扇貝性腺中性類(lèi)固醇激素含量的變化及其與生殖過(guò)程的相互關(guān)系說(shuō)明,性激素在性別維持、性腺分化、配子發(fā)生和排放等過(guò)程中均發(fā)揮著重要在潛的作用。
　　在脊椎動(dòng)物中,17β-羥類(lèi)固醇脫氫酶(17β-HSDs)是類(lèi)固醇合

5、成和代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。盡管研究表明性類(lèi)固醇激素在軟體動(dòng)物的生殖過(guò)程中具有重要作用,但是軟體動(dòng)物中17β-HSDs的存在和功能研究還很少。本文在櫛孔扇貝中克隆并鑒定出了17β-HSD8基因,該基因cDNA全長(zhǎng)1104 bp,具有759 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼252個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,櫛孔扇貝17β-HSD8屬于短鏈脫氫酶超家族(SDR),并與其他動(dòng)物中的17β-HSD8具有高度的同源性。本文使用原核表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿

6、菌(E. coli)中表達(dá)出了櫛孔扇貝17β-HSD8重組蛋白,并通過(guò)復(fù)性獲得了可溶性的17β-HSD8蛋白。體外酶活性實(shí)驗(yàn)揭示,復(fù)性的17β-HSD8以NAD+作為輔酶,可有效地催化雌二醇轉(zhuǎn)化為雌酮,并可較弱地催化睪酮轉(zhuǎn)化為雄烯二酮。
　　半定量RT-PCR結(jié)果顯示,17β-HSD8 mRNA在增殖期櫛孔扇貝各組織中均有表達(dá),并在消化腺、腎臟和卵巢中表達(dá)量較高,在外套膜、肌肉、鰓和精巢中表達(dá)量較低。qRT-PCR和Western

7、 blot結(jié)果顯示:卵巢和精巢中17β-HSD8 mRNA和蛋白的表達(dá)量均隨著配子發(fā)生過(guò)程逐漸升高;在生長(zhǎng)期和成熟期精巢中17β-HSD8的表達(dá)量顯著性地高于卵巢。原位雜交和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,櫛孔扇貝17β-HSD8 mRNA和蛋白在濾泡細(xì)胞和各期配子(除精子外)中均有表達(dá);配子中陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)度隨著配子的發(fā)育逐漸降低。這些研究結(jié)果表明,櫛孔扇貝17β-HSD8參與調(diào)控配子發(fā)生過(guò)程;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),這種調(diào)控作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)雌二醇水平

8、實(shí)現(xiàn)的。
　　對(duì)櫛孔扇貝胚胎和幼蟲(chóng)中17β-HSD8 mRNA的時(shí)空表達(dá)模式研究結(jié)果顯示:櫛孔扇貝17β-HSD8在未受精卵中即有高水平的表達(dá),顯示它是一個(gè)母源性表達(dá)的基因。在卵裂期胚胎中17β-HSD8的表達(dá)量顯著下降,但是囊胚中其表達(dá)量顯著提高,暗示17β-HSD8合子基因在此時(shí)期開(kāi)始表達(dá)。在隨后的胚胎和幼蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中17β-HSD8的表達(dá)量呈波動(dòng)性變化。原位雜交結(jié)果顯示,17β-HSD8 mRNA陽(yáng)性信號(hào)在各發(fā)育階段胚胎中均

9、勻分布,推測(cè)17β-HSD8可能通過(guò)調(diào)節(jié)性類(lèi)固醇激素水平參與櫛孔扇貝早期發(fā)育的調(diào)控。此外,在D形幼蟲(chóng)中17β-HSD8 mRNA高水平表達(dá),并且內(nèi)臟團(tuán)附近17β-HSD8陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度較高,表明17β-HSD8可能也參與起始器官發(fā)生。
　　綜上,櫛孔扇貝雌二醇和睪酮在性別維持、性腺分化、配子發(fā)生和排放等生理過(guò)程中具有潛在的重要作用;17β-HSD8通過(guò)調(diào)節(jié)性腺中類(lèi)固醇激素含量參與調(diào)控配子發(fā)生過(guò)程,并且可能與胚胎發(fā)育和幼蟲(chóng)器官發(fā)生過(guò)程