SIRT3在HBx介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用.pdf

1、目的：研究沉默信息調(diào)節(jié)因子3（SIRT3）在乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要作用。
　　方法：
　　1.利用熒光探針carboxy-H2DCFDA和流式細胞術(shù)檢測HBV瞬時表達和 HBV穩(wěn)定復(fù)制的細胞中活性氧自由基（ROS）的水平，驗證HBV對細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)作用。
　　2.利用熒光探針 carboxy-H2DCFDA和流式細胞術(shù)檢測過表達HBx突變型HBV和過表達HBx對細胞中活性氧自由基

2、（ROS）水平的影響，探討HBx在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。
　　3.利用Western blot、qRT-PCR檢測分析HBV、HBx對SIRT3蛋白質(zhì)和mRNA表達水平的影響，并進一步利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析HBV/HBx對 SIRT3啟動子活性的調(diào)控作用。
　　4. Western blot驗證 HBx、SIRT3的過表達，通過熒光探針carboxy-H2DCFDA和流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS的水平，GSH/GSSG檢測

3、試劑盒檢測細胞內(nèi)GSH與GSSG的比例來分析SIRT3對HBV、HBx誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。
　　5.細胞免疫熒光、Western blot檢測HBx對細胞DNA損傷標志物γ- H2AX形成的影響；DNA損傷定量試劑盒檢測HBx對氧化損傷的AP位點形成的影響；并通過檢測γ-H2AX和AP位點進一步分析SIRT3在HBx導(dǎo)致的氧化損傷中的作用；MTS和流式細胞術(shù)分別分析在氧化應(yīng)激條件下HBx對細胞存活率和細胞凋亡的影響，并進一步

4、分析SIRT3在其中的保護作用。
　　6. Real-time PCR、Southern blot檢測氧化劑H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)對HBV復(fù)制水平的影響；Real-time PCR、Southern blot檢測抗氧化劑NAC抑制的氧化應(yīng)激反應(yīng)對HBV復(fù)制水平的影響；Real-time PCR、Southern blot分析SIRT3對H2O2促進HBV復(fù)制的影響。
　　結(jié)果:
　　1. HBV穩(wěn)定復(fù)制細胞和 HB

5、V瞬時表達的細胞中活性氧自由基的水平明顯增高。
　　2. HBV基因組中HBx突變能明顯降低HBV對氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)作用，HBx過表達可顯著誘導(dǎo)細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　3. HBx下調(diào) SIRT3的 mRNA、蛋白質(zhì)表達水平；HBx明顯抑制SIRT3的啟動子活性。
　　4. SIRT3拮抗HBx引起細胞活性氧自由基水平增加和GSH/GSSG比例失衡。
　　5. HBx表達增加了γ- H2AX和AP位點的形成，

6、SIRT3過表達減弱HBx對γ-H2AX和AP位點形成的促進作用；氧化應(yīng)激條件下HBx表達降低了細胞存活率，誘導(dǎo)了細胞凋亡，SIRT3過表達減弱了 HBx對細胞存活和凋亡的影響。
　　6.氧化劑H2O2促進HBV的復(fù)制；抗氧化劑NAC抑制HBV的復(fù)制；SIRT3能夠拮抗氧化劑H2O2對HBV復(fù)制的促進作用。
　　結(jié)論：
　　SIRT3減弱HBx介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對宿主細胞造成的氧化損傷，并同時能減弱氧化應(yīng)激對HBV復(fù)制的促