AGEs-RAGE軸激活A(yù)KT信號(hào)通路促進(jìn)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移.pdf

1、目的：探究晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced Glycation End Products,AGEs）對(duì)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(Human Aorta Vascular Smooth Muscle Cells,HASMCs)增殖和遷移的影響，進(jìn)而探究ERK1/2、P38MAPK、JNK及AKT等相關(guān)信號(hào)通路是否參與HASMCs增殖和遷移。進(jìn)一步探究AGEs是否與其受體RAGE以配體-受體相結(jié)合方式啟動(dòng)其下游信號(hào)通路參與HASMCs的增

2、殖與遷移。為糖尿病血管動(dòng)脈粥樣硬化，血管腔內(nèi)成形術(shù)（Percutaneous Transluminal Angioplasty,PTA）術(shù)后再狹窄等狹窄、閉塞性病變的防治提供新的策略。
　　方法：CCK-8法及EdU法檢測(cè)HASMCs在不同濃度AGEs作用下增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述對(duì)應(yīng)濃度條件下的AGEs對(duì)HASMCs周期轉(zhuǎn)換情況；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定HASMCs在上述對(duì)應(yīng)濃度條件的AGEs刺激下其遷移情況

3、，羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色后，通過(guò)激光共聚焦熒光顯微鏡觀察HASMCs纖維肌動(dòng)蛋白(F-actin)的表達(dá)情況；蛋白印跡技術(shù)(western blot)測(cè)定平滑肌細(xì)胞增殖與遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；PD98059（ERK1/2 inhibitor），SB203580(P38 inhibitor),SP600125(JNK inhibitor),LY294002(AKT inhibitor)分別預(yù)處理HASMCs，1小時(shí)之后，再加入一定濃度

4、的AGEs，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24～48h,通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)HASMCs增殖和遷移能力以及與增殖和遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)情況；經(jīng)過(guò)以上實(shí)驗(yàn)的初步探索，我們發(fā)現(xiàn)抑制AKT信號(hào)通路之后，HASMCs的增殖和遷移活性均被明顯抑制，表明AKT通路在AGEs誘導(dǎo)的HASMCs增殖和遷移過(guò)程中同時(shí)發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。故實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選用AKT-siRNA轉(zhuǎn)染HASMCs構(gòu)建起AKT被干擾的細(xì)胞模型，同時(shí)選用RAGE-RANi慢病毒轉(zhuǎn)入細(xì)胞構(gòu)建起RAGE基因

5、沉默的HASMCs模型，以探究AGEs/RAGE軸與AKT信號(hào)通路之間的關(guān)系。慢病毒載體上標(biāo)記有綠色熒光蛋白基因（Green Fluorescein Protein,GFP)，當(dāng)細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染病毒后，可以穩(wěn)定表達(dá)GFP,通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察HASMCs的轉(zhuǎn)染效率，western blot檢測(cè)AKT蛋白和RAGE蛋白的以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。轉(zhuǎn)染成功后，經(jīng)AGEs干預(yù)、誘導(dǎo)，再通過(guò)western blot測(cè)定RAGE、AKT以及增殖和遷移相

6、關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、在一定濃度范圍內(nèi)，AGEs能促進(jìn)HASMCs增殖和遷移。當(dāng)AGEs濃度在0～10mg/l范圍內(nèi)時(shí)，HASMCs增殖活性逐漸增強(qiáng)，在10mg/l時(shí)細(xì)胞增殖數(shù)量達(dá)最高峰，超出范圍后其增殖活性逐漸減弱，且濃度超過(guò)40mg/l后，細(xì)胞開(kāi)始凋亡；當(dāng)AGEs濃度在0～20mg/l范圍內(nèi)時(shí)，HASMCs遷移活性逐漸增強(qiáng)，在20mg/l時(shí)細(xì)胞遷移數(shù)量達(dá)最高峰，超出范圍后其遷移能力逐漸減弱。
　　

7、2、HASMCs經(jīng)PD98059(20μmol／l)預(yù)處理后，其增殖活性被顯著抑制（P<0.05,n=3）；同時(shí)觀察到JNK的特異性抑制劑SP600125(40μmol／l)能顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞遷移（P<0.05,n=3）；而HASMCs經(jīng)SB203580預(yù)處理后其增殖與遷移均無(wú)明顯抑制效應(yīng)（P>0.05,n=3）；但同時(shí)我們也觀察到，HASMCs經(jīng)LY294002(40μmol／l)預(yù)處理后，其增殖和遷移活性均被明顯抑制

8、P<0.05,n=3）；
　　3、HASMCs轉(zhuǎn)染AKT-siRNA后，經(jīng)western blot檢測(cè)，與對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染AKT-siRNA組細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白表達(dá)明顯下調(diào)P<0.01,n=3）。
　　4、HASMCs轉(zhuǎn)染RAGE-RANi慢病毒5天后，熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光，且經(jīng)western blot檢測(cè)，與對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染RAGE-RANi組細(xì)胞內(nèi)RAGE蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01,n=3）。

9、>　　5、HASMCs的AKT基因被干擾后，其增殖、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05,n=3），而當(dāng)其RAGE基因被沉默后，AKT蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)，增殖、遷移相關(guān)蛋白也明顯下調(diào)（P<0.05,n=3）。
　　結(jié)論：
　　1、AGEs能促進(jìn)HASMCs增殖和遷移，且在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為濃度依賴性。
　　2、ERK1/2和JNK分別參與AGEs誘導(dǎo)的HASMCs增殖和遷移，AKT同時(shí)參與AGEs誘導(dǎo)的HASMC