淫羊藿素對MC3T3-E1 Subclone14 ER-MAPK信號通路的影響.pdf

1、目的：觀察淫羊藿素對前體成骨細(xì)胞株 MC3T3-E1Subclone14活力和分化的影響，研究淫羊藿素對于成骨細(xì)胞ER、MAPK信號通路和Runx2轉(zhuǎn)錄因子的影響，明確其作用于成骨細(xì)胞而影響骨代謝的具體靶點，為淫羊藿素治療骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病提供分子學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　?。?）CCK-8法檢測淫羊藿素對成骨細(xì)胞活力的影響；流式細(xì)胞儀檢測淫羊藿素對成骨細(xì)胞周期的影響；茜素紅染色和VON KOSSA染色檢測淫羊藿素對成骨細(xì)胞

2、礦化結(jié)節(jié)形成的影響；天狼星紅染色檢測淫羊藿素對成骨細(xì)胞膠原蛋白表達的影響。
　?。?）ALP試劑盒和 ELISA法分別檢測不同濃度淫羊藿素對成骨細(xì)胞ALP、Col I、OPN合成分泌的影響；QPCR檢測不同濃度淫羊藿素對成骨細(xì)胞ALP、Col I、OPN及轉(zhuǎn)錄因子Runx2 mRNA表達的影響。
　?。?）Western-blot檢測不同濃度淫羊藿素對成骨細(xì)胞p-ERK1/2、p-P38MAPK、p-JNK蛋白表達的影響；<

3、br>　　（4）5μM的ICI182780預(yù)處理30min，QPCR檢測淫羊藿素對成骨細(xì)胞ALP、Col I、OPN mRNA表達的影響；20μM的SB203580預(yù)處理30min，QPCR檢測淫羊藿素對成骨細(xì)胞ALP、Col I、OPN mRNA表達的影響；10μM的PD98059預(yù)處理30min，QPCR檢測淫羊藿素對成骨細(xì)胞ALP、Col I、OPN mRNA表達的影響。
　?。?）5μM的ICI182780預(yù)處理10min

4、，Western-blot檢測淫羊藿素對成骨細(xì)胞p-P38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達的影響.。
　?。?）5μM的ICI182780預(yù)處理10min，免疫熒光檢測淫羊藿素對成骨細(xì)胞p-P38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)不同濃度淫羊藿素干預(yù)細(xì)胞72h，CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）可以顯著提高細(xì)胞活力（P<0.05），且10μM效果最為顯著（P<0

5、.01）；與Control組比較，淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）對細(xì)胞周期無顯著性影響（P>0.05）。
　　(2)與Control組比較，淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）可以顯著的提高細(xì)胞ALP、Col I、OPN mRNA與蛋白的表達（P<0.05），其中10μM組效果最佳（P<0.01）；淫羊藿素（1μM、10μM）可以顯著的提高Runx2 mRNA的表達（P<0.05）。
　　(3)與Control

6、組比較，淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）可以顯著提高P38MAPK蛋白的磷酸化，其中10μM組效果最佳（P<0.01）；淫羊藿素（1μM、10μM）可以顯著提高ERK1/2蛋白的磷酸化，其中10μM組效果最佳（P<0.01）；淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）對JNK蛋白的磷酸化無顯著性影響（P>0.05）。
　　(4)分別加入ICI182780、SB203580和PD98059預(yù)處理后，與單獨使用藥物組比較，10μ

7、M的淫羊藿素促進ALP、Col I、OPN mRNA表達的作用顯著性下降（P<0.01或0.05）。
　　(5)與Control組比較，10μM的淫羊藿素可以顯著性增強P38MAPK和ERK1/2的磷酸化（P<0.05）；加入ICI182780預(yù)處理后，與單獨使用藥物組比較，10μM淫羊藿素促進P38MAPK和ERK1/2蛋白的磷酸化作用明顯減弱（P<0.01或0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）在一定濃度范圍內(nèi)，淫羊

8、藿素（0.1μM、1μM、10μM）對 MC3T3-E1 Subclone14增殖無明顯的影響，但可以提高細(xì)胞的活力，且10μM的淫羊藿素效果最佳。
　　（2）在一定濃度范圍內(nèi)，淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）可以促進MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞的分化、成熟和礦化，且10μM的淫羊藿素效果最佳。
　?。?）在一定濃度范圍內(nèi)，淫羊藿素（0.1μM、1μM、10μM）可以激活ERK1/2、P38MAPK蛋白

9、，且10μM的淫羊藿素效果最佳；淫羊藿素不能活化JNK蛋白。
　　（4）分別阻斷ER、ERK1/2、P38MAPK信號通路，淫羊藿素對ALP、Col I、OPN mRNA表達的促進作用顯著性下降，表明淫羊藿素可以通過 ER、ERK1/2、P38MAPK信號通路促進MC3T3-E1 Subclone14的骨向分化。
　　（5）淫羊藿素能促進MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞分化，且ER、ERK1/2、P38MAPK信號