耐熱、高活性雜合內(nèi)切葡聚糖酶基因的設(shè)計(jì)、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、熱穩(wěn)定性差和催化活性低是當(dāng)前飼用內(nèi)切葡聚糖酶生產(chǎn)和應(yīng)用的瓶頸。本研究著眼于提高酶活較高基因的耐熱性,以瘤胃真菌(Piromyces rhizinflata2301)和耐熱絲狀真菌總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum BCC18080)為親本,將瘤胃真菌內(nèi)切葡聚糖酶的高活性片段和總狀共頭霉內(nèi)切葡聚糖酶的耐熱片段進(jìn)行拼接,設(shè)計(jì)出一種新的雜合內(nèi)切葡聚糖酶基因,合成全基因后用大腸桿菌和家蠶BmNPV/Bac-to-Ba

2、c兩種表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)既耐熱又在生理溫度下酶活高的雜合內(nèi)切萄聚糖酶,系統(tǒng)研究比較了雜合內(nèi)切葡聚糖酶及其親本酶的酶學(xué)性質(zhì)。1.里氏本霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ基因在BmNPV/Bac-te-Bac快速基因表達(dá)系統(tǒng)中的探索性表達(dá)
　　 采用RT-PCR方法克隆了里氏木霉QM9414內(nèi)切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因的cDNA編碼序列(egl2),利用家蠶BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表達(dá)系統(tǒng),在細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的作用下將EGⅡ基因整合到家蠶核型多角體病

3、毒(BmNPV)基因組中,從而產(chǎn)生重組病毒。利用該重組病毒感染家蠶BmN培養(yǎng)細(xì)胞以及家蠶五齡幼蟲,推算得出每只幼蟲能夠生產(chǎn)大約386μg重組內(nèi)切葡聚糖酶,純化蛋白的酶活約為352U/mg rEGⅡ。該重組酶蛋白的最適反應(yīng)溫度為55℃,最適pH為4.0。本試驗(yàn)結(jié)果表明,家蠶BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表達(dá)系統(tǒng)可作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)具有生物活性的重組纖維素酶(如rEGⅡ),為雜合內(nèi)切葡聚糖酶基因在家蠶生物反應(yīng)器中的表達(dá)打下了實(shí)踐基

4、礎(chǔ)。2.雜合內(nèi)切葡聚糖酶CelcdT’C’基因的分子設(shè)計(jì)及合成
　　 瘤胃真菌P.rhizinflata羧甲基纖維素酶基因celA編碼1個(gè)含有纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域Celcd的多肽。Celcd靠近N端是1個(gè)由28個(gè)氨基酸組成的連接肽,而C端則是一段僅由7個(gè)氨基酸組成的接合結(jié)構(gòu)域,由這3部分組成的基因片段被命名為CelcdN’C’。除去CelcdN’C’靠近N端的連接肽(命名為CelcdC’),酶活沒有發(fā)生很大改變,但其熱穩(wěn)定性急劇下

5、降,證明N端連接肽具有穩(wěn)定酶蛋白的作用。CelcdN’C’和CelcdC’對羧甲基纖維素的活性分別為344.9 U/mg和334.5 U/mg蛋白。研究證明,CelcdN’C’是帶有一些外切葡聚糖酶活性但以內(nèi)切葡聚糖酶活性為主的高活性瘤胃真菌纖維素酶,除去N端連接肽的那段區(qū)域CelcdC’為高酶活基因片段。
　　 屬于接合菌門的絲狀真菌總狀共頭霉(S.racemosum BCC18080)能夠分泌耐熱內(nèi)切葡聚糖酶,最適反應(yīng)溫度為

6、70℃,相對而言要高于接合菌門其它霉菌的內(nèi)切葡聚糖酶。經(jīng)過NCBI-BLASTP比對,確定BCC18080內(nèi)切葡聚糖酶的纖維素結(jié)合域和連接區(qū)的序列為耐熱基因T’片段。
　　 委托南京金思特生物公司合成CelcdT'C’全基因,T’片段在N’端,CelcdC’在C’端,從而將CelcdC’以及T’基因片段成功拼接；同時(shí)考慮到后續(xù)實(shí)驗(yàn),在N’端和C’端分別設(shè)計(jì)BamHI和HindⅢ酶切位點(diǎn)。CelcdT’C’全基因以EcoRV平端克

7、隆方式克隆進(jìn)pUC57-simple載體中,并冷凍保存待用。
　　 3.雜合內(nèi)切葡聚糖酶CelcdT’C’基因和親本酶CelcalN’C’基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化
　　 采用亞克隆技術(shù),以pET-30a(+)為表達(dá)載體,在E.coli BL21中表達(dá)了雜合內(nèi)切葡聚糖酶CelcdT’C’基因和親本酶CelcdN’C’基因,分別獲得了陽性重組表達(dá)子BL21CelcdT’C’和BL21CelcdN’C’。在對基因工程菌用I

8、PTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h后,菌液破碎離心取上清,點(diǎn)樣于羧甲基纖維素鈉平板上,50℃培養(yǎng)6 h,經(jīng)過剛果紅染色,在平板上可見明顯的透明圈,說明表達(dá)產(chǎn)物EcelcdT’C’以及ECelcdN’C’都具有羧甲基纖維素酶活性；進(jìn)一步用SDS-PAGE進(jìn)行分析檢測,EcelcdT’C’與ECelcdN’C’分子量分別約為61 kDa和54 kDa,與推導(dǎo)的融合蛋白分子量一致。
　　 根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出,過柱純化后重組CelcdT’C’

9、和CelcdN’C’內(nèi)切葡聚糖酶活性分別為11.12U/ml和16.36 U/ml。它們的最適反應(yīng)溫度都為50℃,在動物生理溫度范圍內(nèi),親本酶CelcdN’C’相對活性較高,在70℃以上高溫,雖然雜合酶CelcdT’C’的酶活性要小于親本酶CelcdN’C’,但是較親本酶表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐熱性；它們的最適反應(yīng)pH都為5.0,其中雜合酶蛋白在小腸的中性環(huán)境中能表現(xiàn)出較高活性,而CelcdN’C’酶蛋白在弱酸性環(huán)境中的酶活性相對較高。
　

10、　 4.雜合內(nèi)切葡聚糖酶CelcdT’C,基因和親本酶CelcdN’C’基因在家蠶蛹中的表達(dá)及大鼠飼喂效果研究
　　 利用家蠶BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了含有CelcdT’C’和CelcdN’C’基因的重組病毒,并先后感染家蠶BmN培養(yǎng)細(xì)胞及家蠶蛹。Westernblot分析鑒定結(jié)果表明,重組CelcdT’C’和CelcdN’C’酶蛋白在BmN細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá),但上清中沒有發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在；在發(fā)病蠶

11、蛹樣品的上清粗酶液中,測得CelcdT’C’/CelcdN’C’的內(nèi)切葡聚糖酶活性為463.4 U/mg CelcdT’C’和477.9 U/mgCelcdN’C’,最適反應(yīng)溫度分別為60℃和50℃。
　　 為了測定所表達(dá)酶的效果,用大鼠評定了飼喂效果。試驗(yàn)分4個(gè)組:基礎(chǔ)日糧(負(fù)對照組)、基礎(chǔ)日糧添加2.0％普通蠶蛹粉(正對照組)、添加2.0％表達(dá)了瘤胃真菌內(nèi)切葡聚糖酶基因的蠶蛹粉(親本酶組)和添加2.0％表達(dá)了雜合內(nèi)切葡聚糖酶

12、基因的蠶蛹粉(雜合酶組),按單因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完成。將感染110 h的家蠶蛹粉碎成粉,按設(shè)計(jì)比例配制大鼠日糧,進(jìn)行為期27 d的飼喂試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在大鼠基礎(chǔ)日糧中添加2.0％的蠶蛹粉不會影響飼料的適口性,添加蠶蛹粉各組大鼠的飼料營養(yǎng)成分消化率(干物質(zhì)消化率、粗蛋白消化率和粗纖維消化率)顯著高于對照組(P＜0.05),雜合酶組消化率高于親本酶組,體重增加有較高趨勢。
　　 綜上所述,本研究設(shè)計(jì)的耐熱、高活性的雜合內(nèi)切葡聚糖酶Celc