鄰單胞菌M6甲基對硫磷水解酶純化及性質(zhì)的研究.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文鄰單胞菌M6甲基對硫磷水解酶純化及性質(zhì)的研究姓名：徐瑋申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：李順鵬崔中利20050701摘要鄰單胞菌M6甲基對硫磷水解酶純化及性質(zhì)的研究捅姜在過去的二十余年里，科學(xué)家們對有機磷尤其是對硫磷的微生物降解進行了廣泛而深入的研究。但是，有關(guān)微生物降解甲基對硫磷的研究報道并不多。我們實驗室在前面的研究中成功地克隆出了一種全新的甲基對硫磷水解酶基因mpd；實現(xiàn)了甲基對硫磷水解酶基因在大腸

2、桿菌中高效表達，并闡明了該水解酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)。為了比較重組表達后融合蛋白與原始蛋白的差異，為甲基對硫磷水解酶的結(jié)構(gòu)功能和應(yīng)用研究提供背景數(shù)據(jù)，本論文旨在首先純化原始菌株鄰單胞菌M6中的MPH，并對其性質(zhì)進行研究。并對另外兩株不同來源的MPH粗酶液性質(zhì)進行了初探，以與鄰單胞菌M6中MPH—t$質(zhì)進行比較。菌體超聲波破碎后得到的粗酶液經(jīng)熱變性、鹽析、二次離子交換層析等一系列步驟純化后，得到了比活提高了6118倍的純酶，整個純化過程的酶活力回

3、收率為504％。純化后的MPH經(jīng)SDS—PAGE驗證為電泳純。酶譜顯示有活性。SDS—PAGE電泳顯示經(jīng)DEAE，Sephadex—A50陰離子交換層析后MPH已經(jīng)獲得了較好的純化效果，電泳圖譜顯示純化產(chǎn)物中只有兩條帶，此樣品再經(jīng)過CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析即得到電泳純的甲基對硫磷水解酶。與低分子蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物相比較，目的蛋白分子量大小約為33KD。建立了新的酶活反應(yīng)體系；酶活單位定義為在250C下每分鐘水解In

4、mol甲基對硫磷、乙基對硫磷或殺螟硫磷即產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚或3一甲基對硝基苯酚所需要的酶量。根據(jù)細(xì)胞定位結(jié)果，M6產(chǎn)生的甲基對硫磷水解酶位于細(xì)胞內(nèi)，而且為組成酶。根據(jù)MPH對甲基對硫磷、乙基對硫磷以及殺螟硫磷的動力學(xué)參數(shù)，MPH對甲基對硫磷農(nóng)藥底物的親和力以及最大反應(yīng)速度要大于其對殺螟硫磷和乙基對硫磷的親和力和最大反應(yīng)速度，對甲基對硫磷的親和力為乙基對硫磷的118倍，最大反應(yīng)速度為乙基對硫磷的2000多倍。從kcat可眥看出MPH

5、對甲基對硫磷的水解效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于乙基對硫磷和殺螟硫磷，分別為乙基對硫磷的490倍和殺螟硫磷的170倍。該酶對甲胺磷、久效磷以及敵敵畏都沒有明顯的降解作用，但能夠降解毒死蜱。過量底物，甲基對硫磷、乙基對硫磷、殺螟硫磷對甲基對硫磷水解酶均有抑制作用。當(dāng)以甲基對硫磷作為底物時，其降解產(chǎn)物對酶有抑制作用；而乙基對硫磷和殺螟硫磷的降解產(chǎn)物對酶沒有抑制。PNP作為三者共同的降解產(chǎn)物之一對酶活沒有抑制作用，甲基對硫磷的另一個降解產(chǎn)物二甲基硫代磷酸鹽對