H2S通過PKCα-FXR及AKT-HNF4α信號(hào)途徑抑制HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá).pdf

1、血漿脂蛋白（a）[LP(a)]是人類血漿中一個(gè)遺傳性質(zhì)復(fù)雜的脂蛋白。LPA基因[包括Kringle IV拷貝數(shù)和單核苷酸多態(tài)性（SNP）]是決定LP（a）濃度變化的主要因素，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化（AS）和冠狀動(dòng)脈心臟疾病（CDH）來說高脂蛋白（a）水平是其發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。但至今為止仍然缺少專一有效的方法來下調(diào)高 Lp(a)血癥患者血漿中的Lp(a)水平，目前臨床上也是缺乏高效安全降低血漿LP（a）水平的治療方法，但是經(jīng)過一系列研究發(fā)現(xiàn)通

2、過單采高風(fēng)險(xiǎn)患者降低高血漿LP（a）水平與最大限度地降低低密度脂蛋白膽固醇水平可以顯著降低冠脈事件的發(fā)生。載脂蛋白(a)[apo(a)]它是LP(a)的特異性抗原，大量的研究表明Lp(a)血漿濃度個(gè)體差異非常大，并因?yàn)閍po(a)基因的表達(dá)而呈現(xiàn)出高度遺傳性，而生活方式、年齡等對(duì) Lp(a)水平影響甚微。所以降低 apo(a)的合成是目前下調(diào)血漿中 Lp(a)的主要策略。有一些研究發(fā)現(xiàn)激活膽汁酸受體(法尼醇X受體，F(xiàn)XR)后可以通過與L

3、PA啟動(dòng)子上正向重復(fù)元件1中的-826和-814之間區(qū)域的調(diào)控元件DR-1位點(diǎn)相結(jié)合，并可以發(fā)揮抑制LPA基因轉(zhuǎn)錄的作用，從而起到抑制Lp(a)表達(dá)的作用。肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子4α（HNF4α）也可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到LPA基因啟動(dòng)子的該區(qū)域發(fā)揮促進(jìn)LPA基因轉(zhuǎn)錄的作用，而HNF4α與FXR結(jié)合到LPA基因啟動(dòng)子DR-1位點(diǎn)的平衡失調(diào)，也可能是引起apo(a)表達(dá)水平改變的一個(gè)原因。早期的研究已經(jīng)證實(shí)硫化氫（H2S）具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)如參與了體

4、內(nèi)的糖脂代謝、細(xì)胞的增殖與凋亡及血管新生等的調(diào)節(jié)。而現(xiàn)在，越來越多的研究人員在關(guān)注H2S對(duì)AS的調(diào)節(jié)作用，然而迄今為止，許多的研究結(jié)果表明H2S發(fā)揮抗AS的機(jī)制包括H2S可通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、內(nèi)皮細(xì)胞分泌粘附分子表達(dá)及同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管損傷等，其中蛋白激酶Cα(PKCα)和蛋白激酶B（AKT）通路是H2S調(diào)控糖脂代謝的兩條較為經(jīng)典的信號(hào)通路，最近有研究證明PKCα和AKT可分別通過激活FXR及HNF4α而在HepG2細(xì)胞中

5、起調(diào)節(jié)作用，而FXR和HNF4α也是調(diào)節(jié)血漿中脂蛋白(a)水平的較為常見的信號(hào)分子，故H2S存在下調(diào)apo(a)表達(dá)的分子作用潛質(zhì)。基于此，本課題旨在探究H2S對(duì)HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)的影響及其機(jī)制研究，為研究下調(diào)Lp(a)特異型藥物提供新的靶標(biāo)和方向。
　　第一部分：H2S對(duì)HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)的影響
　?。勰康模萦^察H2S對(duì)HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)的影響。［實(shí)驗(yàn)方法］用含10％胎牛血清的高糖培養(yǎng)基

6、培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)，再換含有不同濃度硫氫化鈉（Sodium hydrosulfide，NaHS）（0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）的新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；及用200μmol/L NaHS處理不同時(shí)間（0、6h、12h、24h）；用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot，WB）檢測(cè) apo(a)的蛋白表達(dá)水平，用 RT-PCR的方法檢

7、測(cè) apo(a) mRNA表達(dá)，ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中apo(a)分泌水平。［結(jié)果］與對(duì)照組相比，隨著NaHS濃度的增加，HepG2細(xì)胞內(nèi)的apo(a)表達(dá)水平及 apo(a)分泌水平呈濃度依賴性下降，其中以100μmol/L、200μmol/L降低效果明顯；而與對(duì)照組相比，隨著NaHS作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞內(nèi)的apo(a)表達(dá)水平及apo(a)分泌水平呈時(shí)間依賴性下降，其中以24h的下降作用最為顯著。［小結(jié)］NaHS呈濃

8、度依賴性及時(shí)間依賴性降低HepG2細(xì)胞中apo(a)蛋白和mRNA的表達(dá)及其分泌水平。
　　第二部分：H2S調(diào)控HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)的機(jī)制
　?。勰康模萏接慔2S影響HepG2細(xì)胞apo(a)表達(dá)的分子機(jī)制。［實(shí)驗(yàn)方法］用無血清高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，分別用FXR siRNA，HNF4αsiRNA，PKCα特異性抑制劑Calphostin C，AKT特異性抑制劑LY294002對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，隨后加入200

9、μmol/L NaHS處理細(xì)胞24h。用Western blot法檢測(cè)HepG2細(xì)胞中FXR、HNF4α、PKCα、M-PKCα、AKT、p-AKT及apo(a)表達(dá)，同時(shí)運(yùn)用RT-PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞中 apo(a) mRNA的表達(dá)變化，ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中apo(a)分泌水平變化。［結(jié)果］H2S顯著上調(diào)FXR、M-PKCα及p-AKT表達(dá)，而下調(diào)HNF4α表達(dá)；抑制PKCα及AKT激活可以反轉(zhuǎn)H2S對(duì)HepG2細(xì)胞中apo(

10、a)蛋白表達(dá)的抑制作用；干擾FXR也可起到相同的效果；而干擾HNF4α后，由于HNF4α干擾后其上游的因子可能通過調(diào)節(jié)其他因子，或是其競(jìng)爭(zhēng)性抑制物 FXR反應(yīng)性增加從而使apo(a)增加不明顯。［小結(jié)］H2S通過PKCα-FXR和Akt-HNF4α通路協(xié)同下調(diào) HepG2細(xì)胞中 apo(a)表達(dá)。［結(jié)論］1.H2S時(shí)間及劑量依賴性抑制apo(a)表達(dá)；2.H2S通過PKCα上調(diào)FXR抑制apo（a）表達(dá)；3.H2S通過AKT下調(diào)HNF4